Bach1、Keap1、PERK、Nrf2調控γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶在慢性阻塞性肺疾病中的作用.pdf

1、目的:通過觀察慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺內紅系衍生核因子相關因子-2(NF-E2 related factor2,Nrf2)、BTB-CNC異體同源體1(BTB and CNC homology1,Bach1)、Keap1(Kelch-like ECH associating protein1)、PERK(PKR-like endoplasmic reticulum kinase)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的表達,

2、探索Bach1、Nrf2、Keap1、PERK和γ-GCS在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的作用和意義,并初步探討其作用機制,為COPD的發(fā)病機理提供新的理論依據,為其治療提供新的策略和方法。
　　方法:分動物實驗和臨床實驗。1.動物實驗:健康雄性SD大鼠16只,隨機分COPD模型組和對照組,每組8只。采用每日熏香煙和兩次氣管內滴入脂多糖(LPS)法制作COPD大鼠模型。測定大鼠肺功能并觀察大鼠肺組織病理形態(tài)學改變;檢測大鼠肺組織

3、中γ-GCS活性,原位雜交和逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)檢測肺組織中Nrf2、Bach1、Keap1、γ-GCS mRNA的表達。免疫組化和免疫印跡(western blot)分析肺組織中γ-GCS與Nrf2、Keap1、Bach1、P-PERK的蛋白水平。2.臨床實驗:手術切除肺癌患者肺組織標本18例,所有患者術前均行肺功能檢測,COPD診斷符合中華醫(yī)學會2002年制定的標準,其中COPD組和對照組各9例,RT-PCR檢測肺組織

4、中Nrf2、Bach1和γ-GCS mRNA的表達,western blot分析肺組織中Bach1、Nrf2和γ-GCS蛋白水平。
　　結果:
　　1.COPD組大鼠FEV0.3和FEV0.3/FVC％較對照組降低(P<0.05)。肺組織病理學改變符合COPD的特征性改變。
　　2.COPD組大鼠支氣管上皮細胞胞漿中γ-GCS和Nrf2mRNA呈強陽性表達;對照組在相應部位呈弱陽表達,兩組圖像吸光度比較差異有統(tǒng)計學意義

5、(P<0.01), Bach1和Keap1mRNA在兩組中均呈陽性表達,比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。RT-PCR顯示,對照組肺中有一定量γ-GCS和Nrf2mRNA表達,但相對于COPD組仍較低(P<0.01),Bach1mRNA在兩組中的表達無顯著性差異(P>0.05)。
　　3.免疫組化顯示:COPD組大鼠支氣管上皮細胞中Nrf2、γ-GCS和P-PERK蛋白表達較對照組明顯增強;而Bach1和Keap1蛋白表達與對

6、照組比較差異無統(tǒng)計學意義。
　　4.核/胞漿蛋白分離及Western blot顯示Nrf2蛋白在對照組主要表達于胞漿,在COPD組胞漿、胞核均有表達,且明顯上調,高于對照組(P<0.01),但是在胞核中的水平明顯升高;Bach1蛋白在對照組主要表達于胞核中,在COPD組主要表達于胞漿,且兩組間無顯著性差異(P>0.05);Keap1在對照組和COPD組均主要表達于細胞漿,兩組間無顯著性差異(P>0.05);P-PERK蛋白在COP

7、D組的表達明顯增強。
　　5.原位雜交結果顯示:COPD組患者肺組織中γ-GCS和Nrf2 mRNA的表達明顯增強,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而Bach1 mRNA的表達在兩組中無顯著性差異(P>0.05);免疫組化結果顯示:Nrf2和γ-GCS蛋白在COPD患者組的肺組織中表達顯著,與對照組比較可見差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而Bach1蛋白在COPD患者肺組織中與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。
　

8、　6.SPSS11.0軟件進行直線相關分析,在大鼠和臨床實驗中可見核內Nrf2蛋白表達與γ-GCSmRNA及其蛋白表達呈正相關,p-PERK蛋白表達與Nrf2蛋白和γ-GCS mRNA表達均呈正相關,核內Bach1/ Nrf2蛋白表達的比值與γ-GCS的表達、FEV0.3、FEV0.3/FVC%呈負相關。
　　結論:
　　1.細胞核內Nrf2和Bach1蛋白水平變化調控γ-GCS的表達,在COPD氧化/抗氧化失衡機制中起重要