三氧化二砷誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS凋亡及對(duì)其STAT3、VEGF表達(dá)的影響.pdf

1、三氧化二砷(arserlic trioxide，As<,2>O<,3>)是我國傳統(tǒng)中藥砒霜的主要成分，幾世紀(jì)前人們就應(yīng)用砷劑治療多種疾病，目前已在臨床得到廣泛的應(yīng)用。20世紀(jì)90年代我國哈爾濱醫(yī)科大學(xué)首先用三氧化二砷治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)取得顯著療效，對(duì)復(fù)發(fā)、難治病例亦有良好療效，且與維甲酸(retinoic acid，RA)無交叉耐藥，亦無骨髓抑制作用，其副作用不

2、明顯，經(jīng)對(duì)癥治療后可迅速消失。上海血液研究所發(fā)現(xiàn)三氧化二砷可誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡和部分分化。在過去的十多年里，三氧化二砷己被廣泛證明是一種治療急性早幼粒性白血病的有效制劑。最近幾年來，國內(nèi)外對(duì)二氧化二砷與腫瘤的研究發(fā)展很快，發(fā)現(xiàn)三氧化二砷對(duì)惡性淋巴系統(tǒng)疾病、白血病甚至實(shí)體瘤都有令人振奮的治療效果。 雖然三氧化二砷應(yīng)用于臨床己取得了很好效果，關(guān)于其應(yīng)用也積累了很多經(jīng)驗(yàn)，但是，人們對(duì)于三氧化二砷治病的分子機(jī)制還知之甚少。目前，這方面的

3、研究在國際上愈來愈成為一個(gè)熱點(diǎn)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷不僅對(duì)急性早幼粒細(xì)胞性白血病有效果，而且對(duì)其他類型的白血病以及其他許多惡性腫瘤都有良好的治療效果。1996年《Scierice》著文稱“這是繼ATRA之后又一另人震驚的發(fā)現(xiàn)”。大量資料表明，三氧化二砷對(duì)多種實(shí)體瘤均具有良好的治療效果，其作用機(jī)制主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、抑制癌細(xì)胞增殖和血管生成等多種細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制治療癌癥。同時(shí)通過對(duì)相關(guān)凋亡基因的調(diào)控及對(duì)一些信號(hào)通路的影響，誘導(dǎo)

4、多種實(shí)體瘤細(xì)胞凋亡。 近年來腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，特別是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究日益受到重視。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(signal trarIsdtmers and activators oftranscription，STAT)是細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子受體信號(hào)的下游效應(yīng)物。目前在哺乳動(dòng)物中已鑒定出STAT家族的7個(gè)成員，即Stat1，Stat2，Stat3，Stat4，Stat5a，Stat5b和Stat6。此信號(hào)通常產(chǎn)生于細(xì)胞膜表面

5、的受體，然后傳輸至細(xì)胞核內(nèi)，STAT在細(xì)胞核內(nèi)與特異性的DNA啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)<'[1-4]>。Stat3(signal transdtlcers and activators of transcription3，Stat3)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3蛋白是近年來研究異常活躍的轉(zhuǎn)錄因子，目前進(jìn)行的一些有關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，已確認(rèn)Stat3信號(hào)途徑是多種人類腫瘤干預(yù)治療有效的分子標(biāo)靶<'[5-8]>。目前國外有關(guān)STAT

6、信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究正蓬勃發(fā)展，但大部分多集中在惡性血液系統(tǒng)疾病(白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨肉瘤)和頭頸部腫瘤、乳腺癌和前列腺癌等方面，國內(nèi)外關(guān)于Stat3在消化系統(tǒng)疾病中的研究才剛剛起步，而探討Stat3與胃癌細(xì)胞和組織關(guān)系的報(bào)道則更少見，因此，發(fā)展?jié)摿薮?。血管?nèi)皮生長(zhǎng)因子(vasctllar endothelial growth factor，VEGF)又稱血管通透因子(vascylar permeability factor，VPF

7、)是1989年由Connolly等發(fā)現(xiàn)并命名的一種糖蛋白，為血管生成的主要調(diào)控因子，是一種強(qiáng)烈的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原和促血管生長(zhǎng)因子，在腫瘤患者體內(nèi)主要來源于腫瘤細(xì)胞，通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面上的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)活性。血管生成對(duì)促進(jìn)實(shí)體瘤生長(zhǎng)和血行播散的作用目前已較明確，腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成的能力已被視為其生長(zhǎng)、浸潤和轉(zhuǎn)移的先決條件，同時(shí)血管生成的發(fā)生還被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵事件。現(xiàn)已經(jīng)證明三氧化二砷能夠抑制腫瘤細(xì)胞血管形成。在V

8、EGF作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮促血管生成作用的過程中，濃度為10 ng/ml的VEGF即可效誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞Stat3磷酸化<'[9]>。而VEGF在腫瘤細(xì)胞內(nèi)是否遵循血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，尤其是Stat3是否參與信號(hào)傳導(dǎo)，目前尚不明確。胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率居各類腫瘤的首位，每年約有17萬人死于胃癌，幾乎接近全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的1/4，且每年新增胃癌患者2萬人以上，是一種嚴(yán)重威脅人民身體健康的疾病。胃癌

9、對(duì)放、化療的敏感性均較低，行胃癌根治手術(shù)的病例有30﹪左右復(fù)發(fā)。因此尋找對(duì)胃癌行之有效的治療方法具有十分重大的意義。 目的：本實(shí)驗(yàn)以胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS為研究對(duì)象，探討三氧化二砷誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制。并探討凋亡過程中三氧化二砷對(duì)凋亡相關(guān)基因p53、bc1-2及細(xì)胞周期調(diào)控基因p21的影響。研究Stat3信號(hào)途徑對(duì)VEGF表達(dá)的影響以及與p53、bc1-2和p21的關(guān)系，及其在凋亡與胃癌血管形成調(diào)控中的作用。旨在探索三氧化二

10、砷誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS凋亡可能的分子機(jī)制，為尋找新的有效治療胃癌的藥物提供理論依據(jù)。 方法：(1)分別用1、5、10 μmol/L三氧化二砷處理AGS細(xì)胞，在培養(yǎng)24、48、72 h后，采用MTT法檢測(cè)三氧化二砷對(duì)該細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖的影響，以不加藥組作為空白對(duì)照； (2)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、3’-OH末端標(biāo)記法(TUNEL)和DNA ladder檢測(cè)細(xì)胞凋亡； (3)FCM和免疫組化法檢測(cè)Stat3和VEGF蛋白變化；(4)用E

11、LISA法檢測(cè)不同濃度和時(shí)間段細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF表達(dá)變化；(5)用RT-PCR檢測(cè)凋亡過程中凋亡相關(guān)基因p-53和bcl-2及細(xì)胞周期調(diào)控基因p21 mRNA的變化。并檢測(cè)VEGF和細(xì)胞信號(hào)通路中Stat3 mRNA的表達(dá)變化；(6)Western Blot檢測(cè)AGS細(xì)胞中P-Stat3表達(dá)變化。 結(jié)果：(1)AGS細(xì)胞經(jīng)三氧化二砷作用后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，且呈劑量和作用時(shí)間依賴關(guān)系； (2)FCM檢測(cè)在細(xì)胞周期G<,1>

12、期前出現(xiàn)“亞二倍體”凋亡峰，并呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系；細(xì)胞周期中G<,2>期細(xì)胞增多，G<,1>期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞的比例未發(fā)生明顯的變化。提示細(xì)胞周期明顯阻滯于G<,2>/M期。 (3)TUNEL標(biāo)記發(fā)現(xiàn)DNA鏈的斷裂，DNA ladder發(fā)現(xiàn)斷裂的DNA呈現(xiàn)‘梯形’條帶變化； (4)凋亡相關(guān)基因p53mRNA表達(dá)升高，bcl-2mRNA表達(dá)明顯降低；細(xì)胞周期相關(guān)基因p21mRNA表達(dá)增高；(5)AGS細(xì)胞凋亡過程中，凋亡相關(guān)基因Stat3

13、表達(dá)下調(diào)，VEGF表達(dá)下調(diào)，其中以10μmol/L濃度的三氧化二砷作用更強(qiáng)。(6)AGS中存在Stat3的組成性激活，且p-Stat3的表達(dá)隨As<,2>O<,3>濃度增大表達(dá)下降。 結(jié)論： (1)不同濃度的三氧化二砷抑制胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS增殖并誘導(dǎo)凋亡，且與凋亡的程度呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。其凋亡發(fā)生機(jī)制可能與凋亡相關(guān)基因p53上調(diào)及抗凋亡bcl-2基因的下調(diào)密切相關(guān)。p21基因表達(dá)下調(diào)可能是誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的機(jī)制之一。(2)細(xì)胞

14、信號(hào)途徑中Stat3蛋白表達(dá)下降，可能作為胃癌細(xì)胞AGS凋亡相關(guān)基因和細(xì)胞周期調(diào)控基因的上游基因，抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的停滯。Stat3還可能作為VEGF的上游基因下調(diào)VEGF基因表達(dá)，阻止胃癌血管的形成，進(jìn)而對(duì)胃癌血管的形成起到調(diào)控作用。 (3)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS中存在Stat3的磷酸化，三氧化二砷通過抑制P-Stat3的表達(dá)，誘導(dǎo)AGS細(xì)胞凋亡。JAK/STAT信號(hào)通路中Stat3的激活與三氧化二砷誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS