大鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突細(xì)胞的體外培養(yǎng)及功能測(cè)定.pdf

1、目的:樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cell,DC)源于造血干細(xì)胞,廣泛分布淋巴組織和非淋巴組織,是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞(antigenpresenting cell,APS)。DC與其他抗原呈遞細(xì)胞相比其最大的特點(diǎn)是能顯著刺激初始型T細(xì)胞增殖。而其他抗原呈遞細(xì)胞僅能刺激已活化的或記憶性T細(xì)胞,因此DC是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者,在免疫反應(yīng)應(yīng)答中具有獨(dú)特的地位。目前認(rèn)為具有典型的樹(shù)突狀形態(tài),膜表面高表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ(ma

2、ior histocompability complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ)類分子,能移行至淋巴器官和刺激初始型T細(xì)胞增殖活化,并且具有一些相對(duì)特異的表面標(biāo)志的一類細(xì)胞方能稱之為DC。所以要鑒定是否是DC往往通過(guò)形態(tài)學(xué),組合型表面標(biāo)志和刺激初始型T細(xì)胞增殖能力三個(gè)方面加以綜合判斷。本文系以8～10周齡近交系SD和Wistar大鼠為研究對(duì)象,應(yīng)用大鼠骨髓來(lái)源DC的體外誘導(dǎo)與擴(kuò)增,以光鏡、掃描電鏡觀察DC的形態(tài)學(xué)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化以及DC表型分

3、析來(lái)研究大鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突細(xì)胞的體外培養(yǎng)及功能測(cè)定。
　　 方法:(1)選擇8～10周齡近交系SD和Wistar大鼠(體重180～200g)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。獲取大鼠骨髓來(lái)源DC,并分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組DC培養(yǎng)基中含有Rgm-CSF和Ril-4,對(duì)照組培養(yǎng)基中不含有Rgm-CSF和Ril-4,培養(yǎng)基其余成分及培養(yǎng)方法相同,進(jìn)行體外誘導(dǎo)與擴(kuò)增。培養(yǎng)期間隔日半量換液1次,并于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和形態(tài),分別培養(yǎng)13天后收

4、獲懸浮細(xì)胞。(2)觀察DC形態(tài)學(xué):①光鏡觀察:培養(yǎng)期間每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。②掃描電鏡觀察(培養(yǎng)13天的實(shí)驗(yàn)組DC用掃描電鏡進(jìn)行觀察)。(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面表型。用相同熒光素直接標(biāo)記的同分異構(gòu)抗體代替標(biāo)記抗體作對(duì)照。(4)制備淋巴細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞分離,將其分別與實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組DC細(xì)胞按不同比例混合,孵育培養(yǎng)后測(cè)492nm吸光度(A)值。(5)所有數(shù)據(jù)以SPSS16.0軟件包進(jìn)行處理,兩組間比較采用t檢驗(yàn),P＜0.0

5、5為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:①光鏡觀察:培養(yǎng)13天后,對(duì)照組大鼠骨髓細(xì)胞呈類圓形,分散生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)組大部分細(xì)胞呈懸浮狀態(tài),細(xì)胞有明顯毛刺。②掃描電鏡觀察:培養(yǎng)13天后,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞表面有大量樹(shù)突狀突起,比較粗糙,某些突起形成薄片樣結(jié)構(gòu),符合典型的DC形態(tài)特征。③大鼠DC特異性表面分子OX-62的表達(dá):其中對(duì)照組DC的OX-62表達(dá)量為40.79±1.49％,實(shí)驗(yàn)組DC的OX-62表達(dá)量為41.44±1.92％,兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

6、意義(P＞0.05)。④共刺激分子表達(dá):對(duì)照組DC前體共刺激分子CD80、CD86陽(yáng)性表達(dá)率分別為14.39±0.98％和17.38±1.11％,而實(shí)驗(yàn)組DC共刺激分子CD80、CD86陽(yáng)性表達(dá)率分別為85.06±2.98％和83.83±3.19％,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。⑤DC對(duì)同種T細(xì)胞的促增殖能力:MLR結(jié)果顯示對(duì)照組DC前體不能有效刺激同種T細(xì)胞增殖,而實(shí)驗(yàn)組DC具有較強(qiáng)的體外刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力,隨著DC

7、數(shù)量的增加,T細(xì)胞的增殖效應(yīng)加強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。本實(shí)驗(yàn)中,我們將貼壁時(shí)間縮短至3小時(shí),改變了以往為去除粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞將大鼠骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)4-6天后懸浮細(xì)胞,培養(yǎng)的DC43％表達(dá)OX-62,與此前相關(guān)報(bào)道的數(shù)據(jù)不同。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,加入Rgm-CSF和Ril-4的培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)骨髓前體細(xì)胞分化發(fā)育為成熟DC。成熟DC具有較強(qiáng)的體外刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力。實(shí)驗(yàn)組的DC前體細(xì)胞經(jīng)過(guò)13天的培養(yǎng),