MTA1蛋白在人髓母細(xì)胞瘤的表達(dá)及調(diào)控侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究.pdf

1、髓母細(xì)胞瘤(Medulloblastoma，MB)是兒童和青年最常見的惡性腦腫瘤之一，主要發(fā)生在后顱窩，常見于小腦蚓部或第四腦室，具有治愈率低、死亡率高、預(yù)后差的特點(diǎn)。髓母細(xì)胞瘤具有極強(qiáng)的浸潤性和轉(zhuǎn)移性，其腫瘤細(xì)胞可向臨近部位的腦組織浸潤、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致第四腦室閉塞進(jìn)而引起顱內(nèi)壓增高的臨床癥狀;同時，腫瘤細(xì)胞也可通過腦脊液途徑沿硬脊膜下腔播散侵犯脊髓;另有研究表明，大約有5％的髓母細(xì)胞瘤也可轉(zhuǎn)移到長骨、肺等身體的其他部位。一直以來，外科手術(shù)

2、輔以放化療一直被認(rèn)為是治療髓母細(xì)胞瘤主要方式，并且使得患者預(yù)后情況得到了明顯的改善，但髓母細(xì)胞瘤患者的5年總體生存率仍較低。因此，研究髓母細(xì)胞瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子生物機(jī)制，對臨床探索出新的治療策略有著非常重要的意義。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(Metastasis-Associated gene，MTA)是一個與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因家族，可表達(dá)于腫瘤中，主要由3類基因(MTA1、MTA2、MTA3)6個亞型(MTA1、MTA1s、MTA1-ZG2

3、9p、MTA2、MTA3和MTA3L)組成。眾所周知，MTA蛋白的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲性和腫瘤患者的預(yù)后情況有著密切的聯(lián)系。大量研究表明，MTA1通過影響蛋白質(zhì)的泛素化在調(diào)控蛋白的穩(wěn)定狀態(tài)、DNA損傷反應(yīng)以及在人血液和上皮性惡性腫瘤中高表達(dá)狀態(tài)等發(fā)揮重要作用。另外，MTA1利用組蛋白去乙?；秃诵◇w重塑的方式調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、DNA損傷反應(yīng)、腫瘤形成以及炎癥反應(yīng)的作用也得到了證實。近年來，關(guān)于MTA1蛋白可能參與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的

4、報道越發(fā)增多。因此，MTA1蛋白有可能成為新的診斷和治療腫瘤的最佳通路和潛在治療靶點(diǎn)。
　　本實驗，我們首先利用免疫組化明確MTA1在人髓母細(xì)胞瘤及瘤旁正常組織中的差異表達(dá)，然后通過RT-PCR、粘附實驗等方式明確MTA1在在髓母細(xì)胞瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，為臨床治療髓母細(xì)胞瘤提供新思路。
　　目的:
　　探討腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(Metastasis-associated gene1，MTA1)在髓母細(xì)胞瘤(Medullo

5、blastoma, MB)中侵襲、轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　標(biāo)本收集:收集南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)外科和東莞市人民醫(yī)院神經(jīng)外科從2010年12月至2014年12月收治的手術(shù)切除和病理確診的29例髓母細(xì)胞瘤患者中，女性14例(48.3％)，男性15例(51.7％)，年齡:5～36年，平均年齡14.17±8.17歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床資料完整;(2)病理診斷確定為髓母細(xì)胞瘤;(3)術(shù)中獲取的腫瘤組織及瘤旁正常組織分

6、別作為實驗組與對照組。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患者臨床資料不完整;(2)伴有其它的原發(fā)腫瘤。每例患者的標(biāo)本離體后立即用10％甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，作4μm連續(xù)切片供檢測用。
　　免疫組織化學(xué)染色檢測MTA1蛋白表達(dá):采用免疫組織化學(xué)法檢測所有標(biāo)本中MTA1蛋白表達(dá)水平，具體步驟按說明書操作，手術(shù)切術(shù)的腫瘤組織及瘤旁正常組織經(jīng)10％中性甲醛溶液固定后，石蠟包埋切片常規(guī)脫蠟水化，采用枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)、0.3％ H2O2分別進(jìn)行抗

7、原修復(fù)和阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后滴加按1:200稀釋后的鼠抗人MTA1多克隆抗體并4℃孵育過夜，第2天取出室溫恢復(fù)30min，PBS清洗后，滴加兔抗鼠二抗并37℃作用30min，PBS清洗后，DAB染色，復(fù)染后封片，同時我們以PBS代替一抗作陰性對照;結(jié)果，以瘤細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞，并根據(jù)雙評分半定量方法進(jìn)行評分:染色強(qiáng)度（無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色或棕褐色為2分），陽性細(xì)胞百分比（陰性為0分，＜20％為1

8、分，20％-50％為2分，＞50％為3分），而且染色強(qiáng)度評分加陽性細(xì)胞百分比評分所得結(jié)果≥2時，即為免疫反應(yīng)(+)，否則為(-)。
　　MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染Daoy細(xì)胞:我們從ATCC公司購得髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞株，同時化學(xué)合成針對MTA1的小干擾序列即siRNA、無義對照序列niRNA、質(zhì)粒載體Lipofectamine2000，將Daoy置于DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％的CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，通過Lipof

9、ectamine2000將化學(xué)合成的MTA1-siRNA及無義序列MTA1-niRNA轉(zhuǎn)染Daoy細(xì)胞內(nèi)，恒溫箱內(nèi)孵育48-96 h，同時以轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體作為空白對照組。
　　RT-PCR檢測MTA1 mRNA表達(dá):Trizol法提取總RNA，利用紫外分光光度計(Qcontums)測純度和濃度，取2μg總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取cDNA5μL作PCR擴(kuò)增，94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延長30s，擴(kuò)增長度為210

10、bp，最后利用凝膠電泳后分析結(jié)果，以MTA1和β-actin擴(kuò)增帶的吸光度比值來評價MTA1 mRNA的表達(dá)水平。
　　Western blot檢測MTA1蛋白表達(dá):收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白、上樣，通過12％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品后轉(zhuǎn)膜，室溫封閉后加入稀釋濃度為1:200的羊抗人MTA1多克隆抗體，4℃孵育過夜后，加入相應(yīng)二抗，孵育、暗室曝光、顯影、定影及分析，其中我們以β-actin作為內(nèi)參標(biāo)志物。細(xì)胞粘附能力實驗:待轉(zhuǎn)染

11、48h后，將對數(shù)期生長的Daoy細(xì)胞利用胰蛋白酶消化法制成單細(xì)胞懸液，然后接種于Matrigel膠預(yù)處理的96孔板中，每孔加1×105細(xì)胞，并設(shè)3個平行孔，分別在孵育30min、60min、90min后用PBS洗滌以除去未黏附的細(xì)胞，采用噻唑藍(lán)(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium，MTT)比色法檢測570nm處的吸光度(A)值并計算粘附率，其公式為粘附率(％)=粘附于Matrigel上細(xì)胞的A值/總細(xì)

12、胞A值×100％。
　　細(xì)胞劃痕實驗:待轉(zhuǎn)染48h后，將對數(shù)期生長的Daoy細(xì)胞利用胰蛋白酶消化法制成單細(xì)胞懸液并接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長到完全融合時，用200μL黃色槍頭在6孔板的底面上沿直線輕輕劃痕制作細(xì)胞傷口模型，PBS沖洗2次后繼續(xù)培養(yǎng)，分別于劃痕后第8h、16h、24h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕愈合情況并拍照。我們以細(xì)胞劃痕愈合百分比表示細(xì)胞的遷移能力(0h的細(xì)胞劃痕愈合為0％)。
　　Transwell小室

13、體外侵襲實驗:將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，在每個下室內(nèi)加入含有10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液500μL，上室加入200此細(xì)胞懸液，每組設(shè)5個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)12h后取出Transwell小室，利用95％乙醇固定并采用棉拭子擦去小室內(nèi)面的基質(zhì)腔，然后通過4％多聚甲醛固定、HE染色，最后在顯微鏡下觀察并拍照。
　　統(tǒng)計分析:應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組數(shù)據(jù)間均數(shù)比較

14、采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組數(shù)據(jù)間均數(shù)比較采用One-Way ANOVA分析。計數(shù)資料以用百分比/率表示，比較采用卡方檢驗。全部數(shù)據(jù)均進(jìn)行雙邊檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.MTA1蛋白在髓母細(xì)胞瘤組織中的陽性表達(dá)率高于瘤旁正常組織的陽性表達(dá)率(P＜0.01);
　　2.MTA1-siRNA組中MTA1的表達(dá)水平較MTA1-niRNA組及對照組明顯降低（均P＜0.05）;
　　3.MTA1

15、-siRNA組中MTA1蛋白量的表達(dá)顯著低于MTA1-niRNA組及對照組(P＜0.05），而MTA1-niRNA組和對照組的MTA1蛋白表達(dá)量無明顯差異(P＞0.05）;
　　4.MTA1-siRNA組中細(xì)胞黏附率顯著低于MTA1-niRNA處理組及對照組細(xì)胞黏附率（P＜0.05），而對照組及MTA1-niRNA組細(xì)胞粘附率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);
　　5.與對照組及MTA1-niRNA組相比，MTA1-siRN

16、A組細(xì)胞的劃痕愈合速度較慢，并出現(xiàn)未完全愈合現(xiàn)象;
　　6.MTA1-siRNA組中穿過Transwell小室基底膜細(xì)胞數(shù)量明顯低于MTA1-niRNA組及對照組（P＜0.05），而對照組和MTA1-niRNA處理組穿過基底膜細(xì)胞數(shù)目之間無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　髓母細(xì)胞瘤中MTA1蛋白表達(dá)水平升高，而且，抑制MTA1的表達(dá)可以降低髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲及黏附能力。因此，MTA1可作為臨床上治療