腫瘤轉移相關基因MTA1的定位與功能研究.pdf

1、腫瘤侵襲轉移相關基因MTA1最初是在1993年發(fā)現高表達于具有高轉移潛能的大鼠乳腺癌細胞系中，后來證實MTA1不僅參與了腫瘤的侵襲轉移過程，還參與了腫瘤其他多種惡性能力的調控，如細胞增殖、血管生成、耐放化療等等，最終導致腫瘤的高復發(fā)和不良預后。雖然已經經歷了20多年的研究歷史，但是我們對于MTA1(cancer metastasis-associated gene1)的作用機制依然所知甚少。目前為止，關于MTA1的作用機制唯一比較清楚的

2、就是核小體重塑和組蛋白脫乙?；疦uRD(Nucleosome Remodeling and histone Deacetylation)復合體。通過NuRD復合體，MTA1參與了多種腫瘤抑癌基因的轉錄抑制。然而，后來發(fā)現MTA1參與的許多過程都不依賴于NuRD復合體，并且NuRD無法解釋MTA1對Pax5、BCAS3、FosB等基因的轉錄激活作用，因此除了NuRD之外，我們推測還存在其他未知的作用機制。至于MTA1的亞細胞定位，現有文獻

3、提示MTA1主要定位于胞核，而對于MTA1更精細的亞細胞定位目前還未見相關報道，而對于MTA1是否存在胞漿定位尚存在爭議。
　　 一個蛋白在細胞中的精確定位及相互作用信息對于揭示其功能及機制具有非常重要的作用。因此，為了更深入地揭示MTA1在腫瘤中的功能機制，我們首先利用免疫組化，細胞免疫熒光、GFP標簽追蹤、Western Blot、IP及原位co-IP等多種技術對MTA1的核漿定位進行了一個全面系統(tǒng)地研究。通過對內源及外源M

4、TA1的精確定位檢測，我們發(fā)現MTA1在胞核及胞漿中均存在明顯分布。同時我們還意外地發(fā)現MTA1在某些細胞的核膜上也有明顯分布，而MTA1穩(wěn)轉高表達細胞系中獲得的MTA1定位追蹤圖片則直接顯示MTA1是一個核漿穿梭蛋白。MTA1在所有我們檢測過的樣品中均有表達，包括人及小鼠成體正常組織、小鼠胚胎組織、結腸癌組織、正常及腫瘤細胞系，表明MTA1在正常及腫瘤細胞均發(fā)揮重要作用。在正常成體組織，MTA1在腦、肝、腎及心肌等組織中表達量相對較高

5、，并且除心肌和骨骼肌之外，MTA1主要定位于胞核。在骨骼肌，MTA1與SMN共定位于肌小節(jié)中的Z線上。而在小鼠胚胎組織，MTA1在腦、眼、脊髓等神經組織處具有明顯高表達，并且在大部分組織中都主要定位于胞漿。通過對高密度結腸癌芯片染色結果的統(tǒng)計分析，我們發(fā)現胞核及胞漿MTA1均參與了腫瘤的進展過程，但在腫瘤細胞的分化調控中，核MTA1發(fā)揮著主要作用。
　　 MTA1在細胞核中發(fā)揮染色質高級結構調控因子的作用。染色質高級結構在調控基

6、因表達及DNA相關生理過程中發(fā)揮著其重要的作用。在該部分研究中，我們首次發(fā)現腫瘤轉移相關基因MTA1是一個染色質高級結構調控因子，它可以導致間期染色質及M期染色體發(fā)生顯著的去凝聚作用。我們發(fā)現在細胞周期中，MTA1與DNA的相互作用呈現一個動態(tài)的、周期性的分離與結合的過程，該周期性過程在有絲分裂前期及末期染色質/染色體結構轉換的過程中發(fā)揮重要作用。雖然MTA1與染色質重塑因子Mi-2具有相互作用并且共同位于NuRD復合體中，但是MTA1

7、的染色質去凝集作用并不依賴于Mi-2。H1可以通過結合于DNA參與維持和穩(wěn)定染色質的高級結構。我們的實驗結果表明MTA1在胞內可以顯著降低H1與DNA之間的相互作用，并且在M期MTA1與DNA的周期性結合與分離有助于調控H1與DNA之間的周期性結合能力，從而參與M期染色質與染色體結構的轉換調控。雖然MTA1可以導致染色質高級結構發(fā)生廣泛的去凝集作用，但是MTA1的高表達只對一小部分基因產生了明顯的轉錄調控作用，包括轉錄激活和轉錄抑制雙重

8、調控作用。MTA1高表達后導致的差異表達基因在分布模式上具有明顯的染色體偏向性，并且上調基因和下調基因具有相似的分布趨勢。差異基因的精確定位結果顯示，上調基因和下調基因大部分以成簇方式分布于染色體的同一區(qū)域中，表明MTA1具有結構依賴性的調控模式。因此，在本部分我們發(fā)現MTA1具有染色質高級結構調控因子的新功能，該功能在細胞周期中染色質/染色體之間的的結構轉變過程中及間期染色質的轉錄活性中調控中均發(fā)揮重要作用。
　　 MTA1在

9、胞漿中通過結合于紡錘體微管發(fā)揮抑制紡錘體檢驗點(SAC)激活的功能。在間期，MTA1少量定位于胞漿，通過與α-tubulin共定位，我們發(fā)現這部分MTA1主要沿著微管分布。在M期，MTA1具有周期依賴性的定位模式，其中大部分時間MTA1都主要定位于胞漿，結合于紡錘體微管并隨之運動。在MTA1與細胞周期調控功能的探索過程中，我們發(fā)現MTA1對nocodazol引起的紡錘體檢驗點激活具有很明顯的抑制作用。MTA1在HCT116細胞中的高表達

10、會導致染色體排列及分離異常，從而顯著增加微核及多核細胞的比例，這些現象都是SAC功能異常的標志性特征。TPR是一個核孔復合體蛋白，其在間期參與mRNA及蛋白的核外轉運調控，而在M期則發(fā)揮SAC的調控功能。通過IF及免疫熒光共定位技術，我們發(fā)現MTA1與TPR在間期核膜及M期紡錘體上均具有相互作用。進一步的實驗驗證結果表明MTA1通過結合并抑制TPR的SAC正向調控功能從而抑制SAC的激活，并且MTA1可以與MAD1-MAD2復合體競爭結

11、合TPR，MTA1高表達可以顯著降低MAD1-MAD2的相互作用，而該相互作用在SAC激活過程中發(fā)揮著關鍵的作用。
　　 另外，MTA1的亞細胞定位及相互作用蛋白質組信息提示MTA1還具有RNA調控功能。有文獻報道MTA1在核仁中為陰性表達，然而通過對內源及外源MTA1在核仁中的精確檢測，我們確認MTA1在核仁中具有普遍但是相對較低的表達水平。高分辨率的免疫電鏡技術結果顯示MTA1在核仁中主要定位于致密纖維組分區(qū)(DFC)及顆粒

12、區(qū)(FC)。MTA1在核仁中的精確定位及相互作用蛋白信息均表明，MTA1在核仁中參與了rRNA的加工剪切及核糖體亞基的裝配過程。另外，我們首次發(fā)現并確認MTA1在胞漿中存在于大量RNP顆粒中。MTA1 RNP顆粒的相關特性分析結果表明，MTA1參與了RNA的運輸、穩(wěn)定性、翻譯及應激狀態(tài)下的儲存調控。通過GO分析，我們發(fā)現在228個MTA1候選相互作用蛋白中有74(32.5％)個為RNA結合蛋白，并且MTA1相互作用蛋白質組高度富集于RN

13、A調控相關功能類別之下，如RNA加工、剪切、翻譯、穩(wěn)定性、核糖體發(fā)生等等。轉錄組測序結果表明MTA1敲降后對966個可變剪切事件產生了顯著影響。并且有趣的是，外源MTA1的高表達對其自身mRNA的可變剪切也具有顯著影響。
　　 綜上所述，我們發(fā)現MTA1是一個在核仁、胞核、核膜及胞漿中穿梭分布的蛋白;其在細胞周期中具有周期性的動態(tài)定位模式;利用MTA1的候選相互作用蛋白我們構建了MTA1在整個基因組中的相互作用網絡。通過以上定位