棉花體細胞胚胎發(fā)生形態(tài)、遺傳分析及初始脫分化相關(guān)基因的克隆與表達分析.pdf

1、棉花不僅是主要的纖維作物，還是重要的油料和蛋白質(zhì)資源，是世界上主要的經(jīng)濟作物之一。棉花生產(chǎn)穩(wěn)定與否，直接關(guān)系到整個農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)民收入和紡織工業(yè)的發(fā)展。因此，對棉花品種進行不斷的改良和創(chuàng)新，培育出更多高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆的新品種，成為棉花育種家們不斷追求的目標。棉花組織培養(yǎng)是育種研究中的有效手段，可以通過各種生物技術(shù)手段加速育種進程，提高育種效率，創(chuàng)造新的育種材料，并可為現(xiàn)代分子育種和基因工程研究提供有效的實驗技術(shù)手段。棉花組織培養(yǎng)工作起步較

2、晚，而且棉花是被公認的體細胞胚胎發(fā)生困難和難于體外遺傳操作的作物之一。因此，研究亞洲棉體細胞胚胎發(fā)生、棉花體細胞胚胎發(fā)生的起源以及遺傳規(guī)律，以及從分子水平揭示棉花細胞脫分化現(xiàn)象等方面的工作，是進一步完善棉花轉(zhuǎn)基因體系的重要途徑。本研究的主要結(jié)果如下：
　　 1、對四十個亞洲棉品種進行了愈傷誘導(dǎo)，以及后期的分化調(diào)控處理，為建立亞洲棉再生體系積累了資料。所有的亞洲棉品種在2,4-D+KT，NAA+KT，IBA+KT三種常用植物激素組

3、合條件下都容易誘導(dǎo)出愈傷，出愈率均為100％。但在不同激素組合上的愈傷狀態(tài)顯著不同，繼代處理表明NK處理更適合于后期的分化調(diào)控處理，能夠獲得狀態(tài)較好的愈傷。此后，通過改變培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基組分，以及其他處理等方式或組合上述處理等方式進行分化調(diào)控，使用了近300種培養(yǎng)基，僅在卡寶品紅染色時發(fā)現(xiàn)了部分類似于胚性愈傷的細胞，但未獲得體細胞胚。
　　 2、對YZ1進行了不同激素組合條件下的體細胞胚胎發(fā)生研究，建立了高效快速的再生體系；并利

4、用組織切片的方法觀察了體細胞胚胎發(fā)生的過程，表明不同植物激素處理條件下的體細胞胚胎發(fā)生方式是不同的。YZ1在8種植物激素（包括不含植物激素）處理上均能通過體細胞胚胎發(fā)生方式獲得再生植株。但不同處理間的體細胞胚胎發(fā)生能力存在顯著差異，IBA+KT處理表現(xiàn)出最高的分化率，可以達到97.6％，是常用植物激素組合2,4-D+KT處理中分化率28.6％的3倍。同時觀察發(fā)現(xiàn)，整個體細胞胚胎發(fā)生過程（從外植體接種到體細胞胚的出現(xiàn)）僅為33天，是目前棉

5、花體細胞胚胎發(fā)生耗時最短的報道。YZ1也能夠在不含植物激素的MSB培養(yǎng)基上也能夠獲得分化。此外，組織學觀察表明，2,4-D+KT和IBA+KT處理中的體細胞胚胎發(fā)生模式不同，胚性細胞團分別起源于初生形成層和皮層細胞，從一定程度上解釋了IBA+KT處理能夠快速促進體細胞胚胎發(fā)生的原因。
　　 3、通過構(gòu)建陸海雜種F1及F2群體，以及8個不同再生能力品種的完全雙列雜交，研究棉花體細胞胚胎發(fā)生遺傳規(guī)律。選擇容易再生的陸地棉品種Coke

6、r201與再生困難的海島棉品種Pima90雜交獲得F1,利用不同植物激素組合誘導(dǎo)兩個親本和F1進行體細胞胚胎發(fā)生，Pima90和F1均不能體細胞胚胎發(fā)生；次年自交獲得F2種子，F(xiàn)2個體經(jīng)過半年多的誘導(dǎo)調(diào)控處理未見一個個體分化。隨后，對容易再生的陸地棉品種Coker201,Coker312,Y668，YZ1,再生困難的陸地棉品種TM-1,EK4及海島棉品種Pima90和Pima3-79，進行完全雙列雜交，獲得了47個雜種F1代種子，同樣進

7、行愈傷誘導(dǎo)和分化調(diào)控處理，僅有陸地棉之間的兩個雜種獲得了再生，且其對應(yīng)的反交沒有獲得再生。隨后，選擇正反交均不能分化的F1（YZ1和EK4雜交獲得）進行自交，獲得的F2群體進行體細胞胚胎發(fā)生遺傳規(guī)律分析；僅有YZ1作父本的F2群體中有14個個體獲得了胚性愈傷，且胚性愈傷狀態(tài)各異，胚胎發(fā)生能力間也存在顯著差異。表明體細胞胚胎發(fā)生能力是一種復(fù)雜的遺傳性狀，可能同時受細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)多個基因的互作控制。
　　 4、構(gòu)建細胞脫分化相關(guān)基

8、因的SSH文庫，對部分相關(guān)基因進行了表達分析，并提出了可能的SAM-dependent轉(zhuǎn)甲基調(diào)控細胞脫分化的分子機制，部分相關(guān)基因進行了初步的功能驗證。利用來自三種不同激素處理誘導(dǎo)6，12,24，72,168小時的下胚軸的cDNA作為tester，以下胚軸的切段作為driver，進行差異表達基因的差減和兩輪PCR擴增后，獲得棉花細胞脫分化相關(guān)基因的SSH差減文庫。對反向Northern雜交中的差異表達明顯的克隆進行測序，共有286個差異

9、表達的cDNA克隆被測序，112個獨立的EST被分離鑒定，且其中有40.2％的EST是第一次被分離鑒定，可能為新發(fā)現(xiàn)的棉花細胞初始脫分化相關(guān)基因。對相關(guān)基因的表達分析表明，GST在植物激素誘導(dǎo)初期的6-24小時內(nèi)高度表達，PRPs在不同處理中優(yōu)勢表達并表現(xiàn)出不同的表達模式，表明它們可能與棉花細胞脫分化關(guān)系密切。此外，棉花SAM代謝途徑中假定的GhSAMS，GhSAMDC，GhSAHH和GhACO3被鑒定，realtime-PCR分析表明

10、，它們的表達水平在激素誘導(dǎo)初期出現(xiàn)兩次明顯的上升/下降過程，且GhSAMS和GhSAHH的轉(zhuǎn)錄表達水平表現(xiàn)出高度正相關(guān)，進一步推測高表達水平的GhSAMS可能與脫分化細胞重新進入細胞周期密切相關(guān)。組織形態(tài)學觀察進一步表明，2,4-D處理條件下的部分細胞在72小時內(nèi)完成脫分化和分裂過程，SAM-dependent轉(zhuǎn)甲基途徑可能通過兩次轉(zhuǎn)甲基活性的改變調(diào)控棉花細胞脫分化過程。此外，差異表達基因在不同處理中的表達模式表明了2,4-D和激動素之

11、間存在著復(fù)雜的互作關(guān)系。
　　 此外，我們借助Gateway技術(shù)構(gòu)建了Extensin和PRPL的RNAi干涉表達載體以及SAMS、EF1A4、PRPL的超表達載體，并利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化YZ1下胚軸。其中PRPL的RNAi轉(zhuǎn)化的下胚軸分化率較對照明顯降低，初步推測可能是PRPL的干涉影響正常的細胞脫分化進程，進而導(dǎo)致正常的體細胞胚胎發(fā)生進程受限。此外，三個超表達基因都已經(jīng)獲得了胚性愈傷和再生植株，PCR檢測陽性轉(zhuǎn)化率為72.