脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與肝細(xì)胞的相互作用及其聯(lián)合移植保護(hù)急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、急性肝功能衰竭是臨床常見(jiàn)危重癥，一直以來(lái)無(wú)肯定有效的治療措施，病死率居高不下，維持在60％-80％。原位肝移植被認(rèn)為是肝衰竭最佳的治療手段，但因供肝來(lái)源少、成本高、手術(shù)復(fù)雜、術(shù)后需長(zhǎng)期免疫抑制治療促使人們尋找更適宜的方法。肝細(xì)胞移植作為器官移植的替代治療，已經(jīng)證實(shí)在治療肝衰竭及代謝缺乏性肝臟疾病方面顯示出良好的療效。但是異種或異體肝細(xì)胞移植后免疫排斥反應(yīng)是肝細(xì)胞移植失敗的首要原因。其次肝細(xì)胞體外存活時(shí)間短，不能大量增殖及傳代。在這種情況

2、下，研究者致力于干細(xì)胞的移植治療以期望克服這些不足。
　　 近年來(lái)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植已成為治療急性肝功能衰竭的新興治療手段。干細(xì)胞能自我復(fù)制且具有多向分化潛能，在適宜的條件下能分化成需要的細(xì)胞并具有相應(yīng)功能。更重要的是，MSCs與胚胎干細(xì)胞比較，更符合倫理要求，具有免疫調(diào)節(jié)功能，體外能大量增殖且增殖速度快。在MSCs的眾多組織來(lái)源中，脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs)具有

3、來(lái)源豐富，免疫原性低等優(yōu)勢(shì)，有可能成為治療終末期肝病最佳的細(xì)胞來(lái)源，但治療的時(shí)效性、安全性和潛在的療效還需進(jìn)一步證實(shí)。由于單獨(dú)的MSCs或肝細(xì)胞移植治療的局限性限制了下一步的研究，因此我們?cè)O(shè)想是否能采取聯(lián)合移植的方法，起到兩種細(xì)胞在細(xì)胞功能、免疫調(diào)節(jié)等方面相互協(xié)同作用，從而避免單獨(dú)移植的局限性。
　　 為此，本實(shí)驗(yàn)首先分離人不同部位來(lái)源(包括眼袋、皮下)脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose derived me

4、senchymla stem clells，hAMSCs)和鼠肝細(xì)胞，將分離的MSCs行表面分子標(biāo)志鑒定以及成骨成脂誘導(dǎo)，并對(duì)不同部位來(lái)源的hAMSCs行生物活性比較；其次體外在肝衰竭病人血清(hepatic failure serum HFS)刺激下，將兩種細(xì)胞以不同比例分別行間接或直接共培養(yǎng)，以及在無(wú)血清刺激下長(zhǎng)期間接共培養(yǎng)，從細(xì)胞因子水平、基因表達(dá)、細(xì)胞功能等多方面探討兩種細(xì)胞的相互作用及可能的作用途徑；最后將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(a

5、dipose derived mesenchymal stem cell，AMSCs)用菲立磁標(biāo)記后，與肝細(xì)胞聯(lián)合移植急性肝損傷大鼠模型，證實(shí)聯(lián)合移植的有效性及優(yōu)越性。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要的研究結(jié)果如下：
　　 1、采用Ⅳ型膠原酶消化法獲得了大量、穩(wěn)定、快速分離不同部位組織(包括皮下、眼袋)hAMSCs的方法。流式細(xì)胞儀表面分子鑒定提示分離的細(xì)胞具有MSCs的表型特征，而不表達(dá)造血干細(xì)胞或上皮細(xì)胞的標(biāo)志物。分離的細(xì)胞具有成

6、骨、成脂誘導(dǎo)分化潛能。比較了兩個(gè)不同部位(皮下、眼袋)來(lái)源的單位質(zhì)量脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞獲得數(shù)量，細(xì)胞貼壁率，細(xì)胞曲線以及衰老相關(guān)性β-半乳糖苷酶染色，證實(shí)了單位質(zhì)量眼袋脂肪組織獲得的干細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞貼壁率高于皮下脂肪組織，但是在細(xì)胞衰老、細(xì)胞生長(zhǎng)速率方面沒(méi)有差別。
　　 2、hAMSCs與鼠肝細(xì)胞分別以(1:5、1:10、1:20、1:50)四個(gè)不同比例直接混合培養(yǎng)，加入：HFS刺激72h與肝細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)比較。結(jié)果表明混合培養(yǎng)

7、組能減輕HFS對(duì)肝細(xì)胞的毒性刺激，且最適宜的混合比例是1:10。證實(shí)了hAMSCs具有保護(hù)HFS對(duì)肝細(xì)胞毒性損傷的作用。
　　 hAMSCs與肝細(xì)胞以1:10比例間接混合培養(yǎng)，加入HFS72h，收集培養(yǎng)上清液測(cè)定細(xì)胞因子水平和肝功能，并對(duì)間接培養(yǎng)組上層間充質(zhì)干細(xì)胞行基因表達(dá)檢測(cè)。在測(cè)定細(xì)胞因子中，只有IL-6水平明顯增高。加入IL-6抗體后，細(xì)胞存活率、肝細(xì)胞分泌的白蛋白及尿素氮水平明顯下降。提示IL-6是對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)作用的

8、重要細(xì)胞因子。RT-PCR和細(xì)胞功能檢測(cè)顯示共培養(yǎng)上層hAMSCs在血清刺激72h內(nèi)不表達(dá)肝細(xì)胞特異性基因，也不具有肝細(xì)胞的代謝功能。而hAMSCs和鼠肝細(xì)胞在無(wú)肝衰竭血清
　　 刺激下長(zhǎng)期體外混合培養(yǎng)，從第7天開(kāi)始間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，并具有肝細(xì)胞形態(tài)和功能。提示hAMSCs對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用在肝衰竭血清作用初期是通過(guò)免疫調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的，而不是通過(guò)轉(zhuǎn)分化作用。
　　 3、用普魯士藍(lán)染色SPIO標(biāo)記hAMSCs，可

9、見(jiàn)標(biāo)記細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有多少不等的藍(lán)染鐵顆粒，且細(xì)胞活力、生長(zhǎng)能力、增殖功能沒(méi)有受到影響，顯示SPIO成功標(biāo)記hAMSCs。從尾靜脈、股靜脈、門(mén)靜脈三種途徑移植SPIO標(biāo)記的hAMSCs治療CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠模型。移植7天后大鼠的一般情況好轉(zhuǎn)，肝功能、肝組織改善顯著，但是三種途徑間療效沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。移植后血清細(xì)胞因子水平IL-6，IL-10，IFN-γ較對(duì)照組均有明顯增高，p<0.05，提示免疫調(diào)節(jié)作用可能是hAMSCs治療

10、急性肝損傷的機(jī)制之一。
　　 hAMSCs與肝細(xì)胞聯(lián)合移植與hAMSCs、肝細(xì)胞單獨(dú)移植做比較，hAMSCs與肝細(xì)胞聯(lián)合移植治療是可行的，并且在肝功能改善、肝臟組織修復(fù)方面優(yōu)于hAMSCs或肝細(xì)胞單獨(dú)移植。
　　 總之，本研究在成功分離hAMSCs的基礎(chǔ)上，對(duì)人兩個(gè)不同部位AMSCs的生物學(xué)特性進(jìn)行了較深入的研究，從細(xì)胞因子水平、肝功能、基因表達(dá)等方面探討了hAMSCs和肝細(xì)胞間的相互作用。證實(shí)了hAMSCs具有保護(hù)肝細(xì)