豬2型鏈球菌氨基甲酸激酶與鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的克隆與表達.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis）是一種重要的人畜共患病病原菌，能引起包括腦膜炎、敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎和關節(jié)炎等多種疾病。該菌有33個血清型，以2型菌的致病力最強。它公認的毒力因子有莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白、胞外因子、溶血素等，但最近發(fā)現(xiàn)的一些菌株不具有上述一種或幾種毒力因子，卻具有強致病性，表明豬鏈球菌2型存在更復雜的致病機制。 本研究根據(jù)GenBank公布的豬鏈球菌2型（SS2）98HAH33株的氨基甲酸激酶

2、（carbamate kinase，CK）序列設計并合成一對引物，在引物的5’端分別加入含有EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點序列。以SS2青海株基因組為模板，通過PCR擴增出CK的完整編碼基因，將其克隆入pMD18-T simple載體中，并進一步亞克隆入pET32a（+）中，轉(zhuǎn)化E．coli BL21（DE3），篩選陽性轉(zhuǎn)化子，通過IPTG誘導表達目的蛋白。測序結果表明該基因長度為948bp，核苷酸序列與GenBank上公布的98H

3、AH33株的ck序列完全相同。SDS-PAGE檢測表明表達出分子量約53kD的融合蛋白，經(jīng)鎳柱親和層析純化后，Western blot分析表明，此融合蛋白能與SS2青海株全菌制備的兔抗血清發(fā)生特異性反應。表明CK融合蛋白得到了成功表達。為分析氨基甲酸激酶的特性、功能奠定了基礎，有助于進一步研究豬鏈球菌2型對宿主感染的分子機制。 根據(jù)豬鏈球菌2型（SS2）98HAH33株鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（Ornithine Carbamoyl t

4、ransferase，OCT）序列設計一對含NdeⅠ和HindⅢ的引物，以SS2青海株基因組為模板擴增OCT全基因序列，克隆至pET28a（+）原核表達載體中，轉(zhuǎn)化E．coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，通過IPTG誘導表達OCT融合蛋白。核苷酸測序表明oct基因長1014bp，與已登錄的98HAH33株oct序列同源性為100％。SDS-PAGE檢測到40kD的OCT融合蛋白，酶活性分析試驗表明此融合蛋白具有OCT活性，最適反應溫