腺苷緩釋生物敷料在糖尿病潰瘍中的作用研究.pdf

1、國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）的評估報(bào)告顯示，2013年全世界共有約3.82億糖尿病患者，同時(shí)約3.16億人糖耐量受損，成為糖尿病的極高危人群。從2000年開始，國際糖尿病聯(lián)盟就一直在關(guān)注糖尿病在全世界的發(fā)展及變化。過去，人們一直認(rèn)為糖尿病一種“富貴病”，這種錯覺多半與肥胖人群的高發(fā)病率因素相關(guān)，然而研究人員調(diào)查的數(shù)據(jù)顯示，全世界80％的糖尿病患者集中在中等收入和低收入的國家。中國目前共有糖尿病患者9200萬人，已經(jīng)超越印度，成為了全世界糖尿

2、病人口最多的國家。同時(shí)糖尿病在兒童和青年人群中的發(fā)病率也有不斷升高趨勢，這值得引起全世界的關(guān)注。糖尿病患者一生中發(fā)生糖尿病足的概率高達(dá)25%，而在每年因?yàn)榉莿?chuàng)傷造成的截肢人群中，糖尿病患者約占85%以上。全球每30s就有一個病人的下肢因糖尿病而被截除。不僅如此，這些接受截肢手術(shù)后的患者，除了面對行動不便、疼痛等諸多問題外，其5年生存率僅為31%。有研究稱，僅在糖尿病被診斷的最初2年，糖尿病足的治療費(fèi)用就高達(dá)30724美元。因此在應(yīng)對糖尿

3、病問題上，必須聯(lián)合全世界的共同努力，只有在這個基礎(chǔ)上采取有效的手段，才能贏得人類未來的健康和幸福。
　　糖尿病足發(fā)生的一個主要病因是外周血管病變。糖尿病患者出現(xiàn)的組織灌注減少和微血管發(fā)生病變，對外周神經(jīng)病變的發(fā)生同樣起了重要的負(fù)面作用。正常傷口的愈合是由多種細(xì)胞共同參與的一個過程。高血糖可以同時(shí)對參與修復(fù)的干細(xì)胞、白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮與平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生干擾作用，而組織缺血使傷口環(huán)境更加惡化，最終結(jié)果表現(xiàn)為潰瘍不愈合。干細(xì)胞被認(rèn)

4、為是影響組織修復(fù)的關(guān)鍵因素，其正常狀態(tài)下主要以休眠狀態(tài)存在于成年人的骨髓中，當(dāng)組織受到損傷時(shí)，干細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）可以向傷口周圍遷移，通過旁分泌機(jī)制和向ECs分化的途徑促進(jìn)血管再生，從而加速傷口愈合。然而在潰瘍周圍惡劣的環(huán)境下，移植干細(xì)胞的生存狀況差，一直是干細(xì)胞治療面臨的一個難題。因此，解決糖尿病潰瘍移植干細(xì)胞存活率低的問題，將極大地改善其治療效果。
　　腺苷（ADO）作為細(xì)胞的一種代謝分子，經(jīng)研究證實(shí)可以通過直接或

5、者間接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)血供的平衡，在血管再生過程中發(fā)揮十分重要的作用。而ADO對缺血心肌的保護(hù)作用也引起很多關(guān)注。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)與再生和修復(fù)過程必不可少的免疫系統(tǒng)，同樣與ADO密不可分。ADO可以直接作用于免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)VEGF，IL-6，IL-8，bFGF等與血管再生至關(guān)重要的生長因子的分泌。本研究認(rèn)為，在惡劣的傷口環(huán)境下，如果ADO能夠促進(jìn)干細(xì)胞的存活或者增強(qiáng)干細(xì)胞的部分功能，將可以進(jìn)一步改善對潰瘍的治療效果。雖然已經(jīng)有諸多證據(jù)

6、，但是本研究仍然對ADO在體內(nèi)和體外能否發(fā)揮保護(hù)移植干細(xì)胞的作用存在疑問。
　　新型敷料的出現(xiàn)，在促進(jìn)傷口愈合的多個方面給與了更多的支持，同時(shí)與干細(xì)胞聯(lián)合使用可以在移植初期對干細(xì)胞的生存環(huán)境進(jìn)行一定的改善。本研究通過電紡絲的方法合成的新型敷料具有良好的生物活性。而殼聚糖、纖維蛋白等新型緩釋生物材料的出現(xiàn)，使對藥物釋放有了更多的控制?？紤]到腺苷在體內(nèi)極短的半衰期，本研究進(jìn)一步提出了問題，如果ADO能在糖尿病潰瘍的治療上發(fā)揮有利作用，

7、設(shè)計(jì)ADO緩釋的新型材料是這一問題的先決條件。
　　要解開上述提到的三個問題，必須一步步的用實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。接下來本研究將分為三個章節(jié)來對上述問題進(jìn)行更加深入的研究。
　　一、ADO對間充質(zhì)干細(xì)胞在高糖條件下保護(hù)作用的研究
　　間充質(zhì)干細(xì)胞由于其多項(xiàng)分化潛能和強(qiáng)大的旁分泌作用，在組織修復(fù)的多個領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，而被認(rèn)為是干細(xì)胞治療糖尿病潰瘍的最佳選擇。目前研究表明，糖尿病患者體內(nèi)包括間充質(zhì)干細(xì)胞在內(nèi)的多種干細(xì)胞的數(shù)量及

8、增殖能力均有不同程度受損，因此持續(xù)性高血糖是導(dǎo)致干細(xì)胞功能受損的主要因素。同時(shí)，也有研究顯示hMSCs細(xì)胞表面表達(dá)腺苷的受體，并且其細(xì)胞的分化受到腺苷的影響。
　　在體外實(shí)驗(yàn)中，將葡萄糖的高糖（HG）濃度設(shè)定在30mol/l，低糖（Ctrl）對照組設(shè)定為5.5mol/l，同時(shí)根據(jù)前期研究將ADO的作用濃度設(shè)定為100mmol/l。將在低糖條件下正常生長的第5-8代hMSCs中加入高糖培養(yǎng)基以此作為對照組，并將100mmol/l A

9、DO作為刺激源加入高糖培養(yǎng)基中作為實(shí)驗(yàn)組。通過對比CCK-8、transwell和ELISA實(shí)驗(yàn)，來對高糖條件下的MSC的增殖、遷移及旁分泌作用進(jìn)行測定。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在短時(shí)間的高糖條件下，hMSCs的增殖與遷移能力并沒有明顯受損，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)ADO對hMSCs的增殖并沒有產(chǎn)生顯著影響，而在沒有外來趨化因子作用下，hMSCs的遷移能力也并沒有受到 ADO的改變。但是我們意外的發(fā)現(xiàn)，ADO刺激明顯增加了hMSCs多種生物活性物質(zhì)的

10、分泌，VEGF、bFGF和IL-8的表達(dá)明顯上調(diào)。這個結(jié)果說明ADO雖然對細(xì)胞增殖與遷移沒有直接性影響，但是對細(xì)胞功能的改善作用是突出的。這也暗示其對細(xì)胞的功能的改善將有可能直接影響其治療糖尿病潰瘍的效果。
　　通過對hMSCs表面不同的ADO受體進(jìn)行選擇性的阻斷和對應(yīng)誘導(dǎo)劑的使用，讓我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了ADO對hMSCs作用的發(fā)生與其表面受體的對應(yīng)關(guān)系，這將對今后ADO及其作用機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　二、腺苷緩釋生物材料

11、的設(shè)計(jì)
　　糖尿病潰瘍作為一種慢性開放性創(chuàng)傷，其治療和護(hù)理必然要用到的醫(yī)用敷料這一重要醫(yī)療用品。傳統(tǒng)敷料雖然可以應(yīng)對大多數(shù)傷口護(hù)理的需要。但是在糖尿病潰瘍治療匯總暴露出來的一些不足例如：不能保持傷口的濕潤環(huán)境，浸濕后致病微生物容易通過和纖維脫落造成異物反應(yīng)等，這些都可能延緩傷口的愈合。這在糖尿病潰瘍的治療中顯然不能夠滿足本身已經(jīng)難以愈合的傷口治療需求。因此，開發(fā)對糖尿病潰瘍的特點(diǎn)更加具有針對性的新型敷料的愿望變得尤為迫切。同時(shí)調(diào)查

12、還顯示隨著移植需求的擴(kuò)大，以及移植技術(shù)和再生醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，聯(lián)合支架、藥物、細(xì)胞和生長因子的新型生物療法將成為未來再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展方向。
　　研究人員通過對糖尿病潰瘍的研究，在新型生物敷料的開發(fā)上提出了更高的要求。理想的新型生物敷料應(yīng)該滿足以下條件：維持傷口周圍的濕潤環(huán)境、抗菌（能夠保護(hù)潰瘍免受二次感染的危險(xiǎn)）、清除壞死組織及分泌物和促進(jìn)潰瘍區(qū)域的組織再生。雖然現(xiàn)有的敷料都難以在所有的方面滿足上述條件，但是新型生物敷料已經(jīng)在朝著這

13、個目標(biāo)不斷進(jìn)步，相比于傳統(tǒng)敷料已經(jīng)具有了很大的優(yōu)勢。目前已經(jīng)有生物聚合材料在實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)了其促進(jìn)組織愈合的治療效果。同時(shí)已經(jīng)有部分生物材料進(jìn)入了商品化階段。
　　為了滿足新型敷料的多元化要求，聯(lián)合應(yīng)用支架、藥物、細(xì)胞的生物敷料無疑是一個絕佳的選擇。在眾多已經(jīng)證實(shí)據(jù)有控釋作用的材料中，在研究中我們嘗試了殼聚糖包埋和殼聚糖聯(lián)合PLA聚合物的電紡絲技術(shù)等，將ADO進(jìn)行物理包埋。殼聚糖是天然存在的生物多糖，其本身具有良好的生物相容性、無

14、毒、無免疫原性的優(yōu)勢。殼聚糖能夠包埋親水性的藥物，是一種良好的載體。通過高分辨率液相色譜對腺苷的緩釋效果進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示單純殼聚糖包埋的ADO能夠延緩釋放，但是緩釋效果并不理想，在體外緩釋試驗(yàn)中2小時(shí)的釋放率約80%，可以說其控制釋放的效果較差。但是殼聚糖包埋及聯(lián)合應(yīng)用電紡絲技術(shù)都明顯延長了對ADO的控釋效果。結(jié)果證明，PLA聚合物不僅可以將將其制備為具有良好的組織相容性的敷料，同時(shí)可以使該新型敷料具有緩釋ADO的效果。
　　三

15、、搭載間充質(zhì)干細(xì)胞的腺苷緩釋生物敷料在糖尿病潰瘍中的作用
　　緩釋生物材料的研發(fā)使藥物的在體內(nèi)釋放的可控性大大增加。而以此為基礎(chǔ)的聯(lián)合多種藥物的緩釋技術(shù)仍然困難重重。研究人員在針對不同的藥物的固有特定與緩釋要求的緩釋上不得不設(shè)計(jì)更多的載體來滿足藥物組合的個性化需求，這無疑是極為困難的。雖然已經(jīng)有外用VEGF、EGF等生長因子以及聯(lián)合使用抗生素藥物等促進(jìn)潰瘍愈合的作用研究，并取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是單一應(yīng)用一種生長因子從治療效果來

16、說仍然是十分有限的。
　　怎樣才能使糖尿病潰瘍獲得更好的治療效果，我們不得不考慮如何在現(xiàn)有條件下解決上述難題。事實(shí)上我們已經(jīng)知道了間充質(zhì)干細(xì)胞本身具有強(qiáng)大的旁分泌作用，其分泌的VEGF、bFGF、TGF-β等一系列生物活性物質(zhì)在促進(jìn)組織修復(fù)過程中都是極為重要的。同時(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞還能夠調(diào)控免疫細(xì)胞的功能，改善傷口區(qū)域的惡劣環(huán)境，將炎癥反應(yīng)階段轉(zhuǎn)化為修復(fù)階段，這將為后期的組織修復(fù)創(chuàng)造良好的條件。與此同時(shí)藥物與生長因子將可以更好地發(fā)揮作

17、用，這將會對糖尿病潰瘍以及多種組織損傷的恢復(fù)帶來新的福音。
　　通過將ADO緩釋的新型電紡絲材料作為載體進(jìn)行滅菌處理，將生長狀態(tài)良好的帶有綠色熒光的第5-8代hMSCs-G種植在材料的表面。在5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6小時(shí)。通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的貼壁及生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該生物材料具有良好的細(xì)胞親和性，hMSCs-G在無論是有沒有緩釋ADO的生物材料上均表現(xiàn)出良好的貼壁生長狀態(tài)。我們提取了種植有間充質(zhì)干細(xì)胞的AD

18、O緩釋生物材料的條件培養(yǎng)基，并在體外實(shí)驗(yàn)中將其加入到ECs與FCs的培養(yǎng)基，檢測結(jié)果顯示，對比與沒有ADO的緩釋材料，ADO緩釋刺激下的hMSCs表現(xiàn)增強(qiáng)的促進(jìn)ECs和FCs的增殖與遷移的效果。并且該效果在短時(shí)間內(nèi)并沒有受到高糖作用的影響。
　　為了進(jìn)一步證實(shí)搭載間充質(zhì)干細(xì)胞的ADO緩釋生物敷料的治療效果，本研究中以C57小鼠為對象，通過腹腔注射STZ溶液的方法誘導(dǎo)了小鼠的糖尿病模型。并通過顯微手術(shù)結(jié)扎了小鼠的股動脈遠(yuǎn)端，并在小鼠

19、下肢的外側(cè)切除了5×5mm的全層皮膚組織，以此來完成缺血性糖尿病潰瘍的動物模型。將表面種植了 hMSCs-G的生物材料覆蓋在潰瘍的傷口區(qū)域，并進(jìn)行包扎固定。觀察糖尿病潰瘍的愈合速度發(fā)現(xiàn)，ADO緩釋組的愈合速度明顯高于不含ADO的實(shí)驗(yàn)組。組織學(xué)觀察也進(jìn)一步確認(rèn)，ADO緩釋組小鼠潰瘍區(qū)域表現(xiàn)出更高的血管密度。動物實(shí)驗(yàn)充分證實(shí)了搭載干細(xì)胞的ADO緩釋生物敷料對糖尿病潰瘍的治療效果。
　　綜上所述，通過本文上述的三個部分的研究，首先，在體

20、外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，ADO能夠通過不同的受體增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌作用。其次，為了能夠發(fā)揮ADO在體內(nèi)的持續(xù)刺激作用，本研究通過聯(lián)合應(yīng)用殼聚糖包埋以及PLA聚合物的電紡絲技術(shù)的等手段，制備出了具有良好組織相容性的生物敷料，同時(shí)解決了ADO的緩釋問題。在最后一部分中，本研究將上述兩者結(jié)合起來，并以糖尿病潰瘍小鼠為對象，模擬在高血糖等不利因素的作用下，搭載間充質(zhì)干細(xì)胞的ADO緩釋生物敷料的在體療效。結(jié)果顯示聯(lián)合細(xì)胞、藥物、支架的新型生物敷料通過