急性髓性白血病FLT3表達(dá)與FLT3-ITD及其臨床意義.pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文急性髓性白血病FLT3表達(dá)與FLT3ITD及其臨床意義姓名：劉旭輝申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)（血液?。┲笇?dǎo)教師：金潔20061220發(fā)AML患者80例，其中M0型8例，M1型8例，M2型25例，M3型20例，M4型6例，M5型13例。部分緩解期患者13例，完全緩解期患者36例。10例正常入骨髓作為對(duì)照。2方法：(1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)FLT3mRNA表達(dá)水平：Trizol一步法抽提骨髓單個(gè)核細(xì)胞總RNA，

2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，F(xiàn)LT3及pactin的引物及探針設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)，常規(guī)PCR擴(kuò)增6例FLT3陽(yáng)性初治AML患者的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，構(gòu)建擴(kuò)增產(chǎn)物的重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒，制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用德國(guó)羅氏公司的LightCycler熒光定量PCR儀，日本Takara公司的PremixExTaqTM定iPCR試劑盒擴(kuò)增，將重組質(zhì)粒系列十倍比稀釋后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用已建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，患者cDNA與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)行定量PCR，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)立pa

3、cti內(nèi)對(duì)照，F(xiàn)LT3與pactin轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的絕對(duì)拷貝數(shù)之比，作為FLT3mRNA表達(dá)水平，用于分析。(2)RTPCR方法檢測(cè)FLT3flTD突變：Trizol一步法抽提骨髓單個(gè)核細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，應(yīng)用美國(guó)MJ公司的PTC200型常規(guī)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，209／L瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物電泳條帶在凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察并拍照。(3)基因組PCR方法檢測(cè)FLT3／ITD突變：Gentra提取DNA試劑盒制備基因組DNA

4、，應(yīng)用PTC200型常規(guī)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，209／L瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物電泳條帶在凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察并拍照。(4)細(xì)胞免疫表型檢測(cè)：采用活細(xì)胞直接免疫熒光法標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)初發(fā)AML患者白血病細(xì)胞免疫表型，髓系抗原采用CDl3、CD33、CDl4、HLADR、MPO，干，祖細(xì)胞標(biāo)志采用CD34。(5)染色體核型分析：采用R顯帶法，核型異常的描述按照國(guó)際人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名體$|I[ISCN(1995)]。根據(jù)預(yù)后的好、中、差