共載鹽霉素鈉和多西他賽的PLGA納米粒靶向乳腺癌細胞及乳腺癌干細胞的體內外研究.pdf

1、乳腺癌是當前威脅人類健康的高發(fā)癌癥，而中國是全球乳腺癌發(fā)病率最高的國家。乳腺癌目前的治療手段主要有手術治療、化學藥物治療、放射治療和免疫治療等，就當前乳腺癌的治療情況而言，臨床使用的化療藥物（紫杉醇類，多柔比星以及順鉑類）雖然都是針對已經分化的乳腺癌細胞進行有效殺滅，但是存在體內毒性較大，治療后易復發(fā)等缺點。目前被廣泛認可的復發(fā)原因主要是腫瘤組織中的乳腺癌干細胞對化療藥物產生耐藥性，在經過一段時間的休眠后，通過自我更新和分化形成新的腫瘤

2、，導致乳腺癌的復發(fā)甚至轉移。
　　針對上述問題，我們提出三種方案:1、分別選取對乳腺癌細胞及干細胞具有顯著選擇性殺傷效果的藥物來殺傷乳腺癌細胞及干細胞，從而有效治療乳腺癌并防止復發(fā)和轉移;2、利用抗腫瘤藥物的協(xié)同比例聯(lián)用來治療乳腺癌，增強對乳腺癌的治療效果;3、通過將藥物包載進入納米載體中，制得的納米藥物具有靶向和降低毒性的特點。結合以上三種方案，本課題選用傳統(tǒng)的抗乳腺癌藥物多西他賽和新型抗乳腺癌干細胞藥物鹽霉素（鈉）聯(lián)用來治療乳

3、腺癌，兩種藥物分別選擇性作用于乳腺癌細胞和乳腺癌干細胞，實現(xiàn)協(xié)同殺傷，以期達到對乳腺癌增強治療的效果。
　　鹽霉素(Salinomycin)是一種環(huán)醚類的離子載體抗生素，可以選擇性作用于多種腫瘤干細胞，包括乳腺癌干細胞。另據(jù)報道，鹽霉素鈉(Salinomycin sodium)也具有相似效果，并具有更高性價比。多西他賽(Docetaxel)是目前臨床治療乳腺癌的一線化療藥物。而聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是已經FDA批準的一

4、種高分子藥用輔料，作為藥物載體具有生物相容性高，體內安全無毒等特點;D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)作為一種出色的非離子表面活性劑，還具有抑制P-糖蛋白的外排作用，提高受P-糖蛋白阻滯的藥物的生物利用度，有效克服腫瘤細胞的多藥耐藥性。據(jù)此，本課題利用PLGA-TPGS納米粒作為兩種藥物的載體，包載抗乳腺癌干細胞藥物鹽霉素鈉和抗乳腺癌藥物多西他賽，靶向遞送至乳腺腫瘤部位，在達到對乳腺癌產生有效治療的同時，也降低藥物對機體正常組織

5、的毒副作用。
　　本課題建立了SAL和DTX的HPLC體外含量測定方法學。SAL的線性方程為:A=1217.7C-3398(r2=0.9999)，線性范圍為:6.25～1000μg/mL.DTX的線性方程為:A=21836C+8557.8(r2=0.9999)，線性范圍為:1～100μg/mL.各項方法學參數(shù)均符合藥物的含量測定要求。為下一步載藥PLGA納米粒的包封率、載藥量測定及體外釋放度的考察奠定了HPLC方法學基礎。

6、　　選擇MCF-7乳腺癌細胞系為模型細胞，并利用無血清懸浮培養(yǎng)技術，從中篩選出MCF-7微球體（MCF-7-TS）作為乳腺癌干細胞模型。通過對乳腺癌干細胞表型標記抗體CD44+CD24-的表達情況作為衡量指標（乳腺癌干細胞鑒定金指標），對作為乳腺癌干細胞模型的MCF-7-TS進行了鑒定，結果顯示，MCF-7-TS細胞中CD44+CD24-的表達率達60％以上，可以將其作為乳腺癌干細胞模型用于后續(xù)實驗。通過體外細胞毒性實驗，SAL對MCF

7、-7-TS具有選擇特異性，而DTX對MCF-7-TS具有耐藥性，選擇性作用于乳腺癌MCF-7細胞;最后，在乳腺癌MCF-7細胞和MCF-7-TS細胞中篩選出DTX與SAL協(xié)同比例為摩爾比2∶1和1∶1.
　　采用納米沉淀法，成功制備出了空白PLGA納米粒、載鹽霉素鈉PLGA納米粒(NS)、載多西他賽PLGA納米粒(MD)及按協(xié)同比例共載鹽霉素鈉與多西他賽的PLGA納米粒(NSD)，并優(yōu)化了PLGA納米粒的處方，選取PLGA與TPG

8、S的最佳比例、SAL與DTX兩藥的最佳投藥比，作為PLGA納米粒的優(yōu)選處方。通過動態(tài)光散射粒徑儀(DSC)、透射電子顯微鏡(TEM)對PLGA納米粒進行了表征，結果表明，成功制備出了分布均勻、外形圓整、粒徑在70-100 nm左右、Zeta電位在-25 mV附近的PLGA納米粒。模擬在正常體內和腫瘤組織中的pH釋放介質條件下，分別對NSD中SAL和DTX的體外釋放情況進行了考察，結果顯示NSD中的兩藥在10d內均具有一定程度的同步緩釋效

9、果。
　　以香豆素-6作為熒光探針，考察了乳腺癌MCF-7細胞和MCF-7-TS細胞對PLGA納米粒載體與游離C-6的攝取情況。結果顯示，乳腺癌MCF-7細胞和MCF-7-TS對載藥PLGA納米粒的攝取能力均高于對游離C-6的攝取能力。以DiR為熒光探針包載于NP中，通過荷瘤裸鼠活體成像，觀察納米粒在臟器與腫瘤中的分布情況，結果顯示，NP作為藥物載體，最主要聚集于腫瘤組織中，相對較少聚集于其他臟器中，因此表明NP具有高靶向乳腺腫瘤

10、組織的特性。通過細胞毒性實驗，考察比較了空白PLGA納米粒、游離藥物單用及聯(lián)用、單載和共載兩藥的PLGA納米粒對乳腺癌MCF-7細胞和MCF-7-TS細胞的細胞毒性。結果顯示，空白PLGA納米粒對乳腺癌MCF-7細胞和MCF-7-TS細胞均無明顯細胞毒性;載藥PLGA納米粒可保持游離藥物對乳腺癌MCF-7細胞和MCF-7-TS細胞的毒性;NS+ND、NSD可保持SAL與DTX對乳腺癌MCF-7細胞和MCF-7-TS細胞的細胞毒性，說明N

11、S+ND、NSD可同時作用于乳腺癌細胞和乳腺癌干細胞且具有較強的殺傷作用。
　　采用HPLC-MS分別考察分析了SAL+DTX、NS+ND及NSD三組處方在雄性SD大鼠體內的SAL和DTX的藥代動力學特征。結果顯示，SAL緩釋效果最優(yōu)的為NS+ND組，DTX緩釋效果最優(yōu)的為NSD組，NSD組更好的保持了SAL與DTX的包載比例。
　　成功建立了MCF-7乳腺癌裸鼠模型，考察了Saline組、NP組、SAL組、DTX組、SAL

12、+DTX組、NS組、ND組、NS+ND組以及NSD組的體內毒性及抗腫瘤活性。結果顯示，空白PLGA納米粒對裸鼠沒有明顯毒性;其中抗腫瘤活性最佳的為NSD組，且沒有明顯的系統(tǒng)毒性，抑瘤率為77.70±4.92.最后，通過對離體腫瘤組織進行無血清懸浮培養(yǎng)MCF-7-TS，考察了各處方的體內抗乳腺癌干細胞活性。結果顯示，NS+ND組與NSD組均可顯著的抑制MCF-7-TS的數(shù)量及體積，說明NS+ND組與NSD組對乳腺癌干細胞具有較強的抑制作用