重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑對乳腺癌細(xì)胞MCF-7作用的研究.pdf

1、乳腺癌作為一種高發(fā)性腫瘤，它的預(yù)防和治療在生物界和醫(yī)學(xué)界越來越受到重視,尋求一種新型有效且低毒性的抗乳腺癌藥物迫在眉睫。近年來植物來源的胰蛋白酶抑制劑預(yù)防和抵制癌癥的功能已成為一個熱點受到特別關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：來自蕎麥中的重組胰蛋白酶抑制劑rBTI(recombinant buckwheat trypsin inhibitor)可以抑制人類白血病細(xì)胞(K562，HL60)以及人類實體瘤細(xì)胞 HepG2，EC9706等的增殖，并

2、促進細(xì)胞凋亡。但rBTI抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及其促進細(xì)胞凋亡的機制和分子靶點還尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，NFκB/p65信號通路在乳腺癌細(xì)胞的產(chǎn)生和發(fā)展中起著較為關(guān)鍵的作用。為了探究重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑rBTI對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的作用及其機制，本研究主要開展以下研究內(nèi)容：
　　1、采用MTT法進行檢測，發(fā)現(xiàn)rBTI能夠明顯的抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖,并呈現(xiàn)出一種劑量依賴的方式。劃痕愈傷實驗表明rBTI可抑制MCF-7細(xì)胞遷

3、移。用不同濃度的rBTI對MCF-7細(xì)胞進行處理后，通過流式細(xì)胞術(shù)對MCF-7細(xì)胞周期和凋亡情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期進程受到阻滯并出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。qRT-PCR和Western Blot檢測周期相關(guān)因子p53、CDK1、CDK2及細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Fas、Bax、Bcl-2在mRNA水平和蛋白水平的表達量，發(fā)現(xiàn)促凋亡基因顯著表達，而抑凋亡基因表達量明顯減少。
　　2、不同濃度的rBTI對MCF-7細(xì)胞進行處理后，運用Weste

4、rn Blot技術(shù)和qRT-PCR對NFκB/p65途徑中p65、IκBα、IKKα/β在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平的表達量進行檢測；通過免疫熒光技術(shù)檢測p65的核轉(zhuǎn)位，結(jié)果顯示IKKα/β表達量顯著升高、IκBα發(fā)生了明顯的磷酸化，同時p65蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)逐漸減少、在細(xì)胞核內(nèi)逐漸增多。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明rBTI可促使ROS水平升高，當(dāng)NAC將ROS抑制后，可從Western blot結(jié)果看出IκBα的磷酸化情況明顯減小， NF-κB/p6

5、5核轉(zhuǎn)位也相對減少。說明NF-κB/p65信號通路的激活與ROS的增加相關(guān)。由此可見，rBTI可促進ROS的產(chǎn)生，IκBα的磷酸化降解，從而誘導(dǎo)p65蛋白的核轉(zhuǎn)位，激活NF-κB/p65信號通路。
　　綜上所述， rBTI阻斷MCF-7細(xì)胞周期進程，促進MCF-7細(xì)胞凋亡，可能是通過激活MCF-7細(xì)胞中NFκB/p65信號通路。
　　3、rBTI和紫杉醇都具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用，但兩者聯(lián)合用藥對腫瘤細(xì)胞

6、的影響尚不明確。本研究通過MTT比色法對rBTI與紫杉醇聯(lián)合用藥對MCF-7細(xì)胞增殖的影響進行檢測；采用流式細(xì)胞術(shù)對MCF-7細(xì)胞的凋亡以及ROS水平進行檢測；利用qRT-PCR和 Western印跡方法，檢測rBTI與紫杉醇聯(lián)合作用后凋亡因子表達情況。結(jié)果表明，rBTI(2.5μM)與紫杉醇（0.05~0.5μM）聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞后，能顯著抑制其增殖。將rBTI與紫杉醇進行聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞，誘導(dǎo)了MCF-7細(xì)胞的凋亡及

7、ROS的產(chǎn)生；同時與rBTI單獨作用時相比，聯(lián)合作用明顯上調(diào)了p53、Bax的表達，促進了IκBα蛋白的磷酸化以及NFκB/p65的核轉(zhuǎn)位；與rBTI組和紫杉醇單獨作用組相比，兩者聯(lián)合用藥明顯下調(diào)了Bcl-2和Cyclin D1的表達。本研究證實，rBTI聯(lián)合紫杉醇可誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，激活NFκB/p65信號通路，協(xié)同誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡。
　　以上研究結(jié)果為rBTI抗乳腺癌作用的研究奠定了基礎(chǔ)，為乳腺癌的治療和聯(lián)合用藥提供了