牛乳鐵蛋白肽（bLF pep）的基因改造、克隆和融合表達(dá).pdf

1、目的：獲得bLF pep的基因序列，依據(jù)bLF peP的結(jié)構(gòu)特征及相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，尋找合適的突變位點(diǎn)，并將bLF pep與突變體(M1和M2)分別在大腸桿菌中克隆和融合表達(dá)，初步測(cè)定它們的抗菌活性。 方法：根據(jù)bLF pep的氨基酸序列，應(yīng)用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，設(shè)計(jì)bLF pep的基因序列。并對(duì)bLF Pep基因進(jìn)行改造，將bLF pep基因序列中第10位Met密碼子ATG用Trp密碼子TGG來(lái)代替，得到突變體M1的基因序列；將

2、bLFpep基因序列中第7、10位的Gin、Met密碼子CAG、ATG分別用Thr、Cys密碼子ACC、TGC來(lái)代替，得到突變體M2的基因序列。分別設(shè)計(jì)、合成兩個(gè)DNA片段，通過(guò)連接反應(yīng)得到兩端有EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位點(diǎn)的二拷貝基因同向串聯(lián)體。將bLF pep、bLF pep突變體M1和突變體M2基因二拷貝串聯(lián)體分別與克隆載體pUC18連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白篩選，挑取陽(yáng)性菌落，抽提重組質(zhì)粒，酶切、PCR鑒定并測(cè)序。測(cè)

3、序正確后將bLF PeP、bLF pep突變體M1和突變體M2基因二拷貝串聯(lián)體分別和表達(dá)載體pGEX-4T-1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取菌落，抽提重組質(zhì)粒，酶切、PCR鑒定并測(cè)序。將鑒定為陽(yáng)性的菌落用IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，SDS-PAGE電泳觀(guān)察表達(dá)結(jié)果。抽提全菌體蛋白，用B-PER GST SpinPurification kit純化得到融合蛋白，然后用凝血酶和羥胺切割融合蛋白。最后用抑菌圈實(shí)驗(yàn)初步鑒定bLF pep、

4、bLF pep突變體M1和突變體M2蛋白的抗真菌活性。 結(jié)果： 1、獲得了bLF PeP、bLF pep突變體M1和突變體M2基因二拷貝串聯(lián)體。 2、分別將bLF PeP、bLF pep突變體M1和突變體M2基因二拷貝串聯(lián)體克隆到載體pUC18上，初步檢測(cè)、篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并測(cè)序，結(jié)果表明與預(yù)先設(shè)計(jì)的bLF pep、bLF pep突變體M1和突變體M2基因序列一致，突變體M1和M2達(dá)到預(yù)期突變效果，同時(shí)二拷貝基因

5、重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 3、構(gòu)建了融合表達(dá)載體pGEX-4T-1與bLF pep、bLF pep突變體M1和突變體M2基因二拷貝串聯(lián)體重組質(zhì)粒，初步檢測(cè)、篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步測(cè)序正確，可以進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 4、二拷貝基因串聯(lián)體插入表達(dá)載體pGEX-4T-1后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h，SDS-PAGE電泳結(jié)果可見(jiàn)約29KD的融合蛋白條帶，說(shuō)明二拷貝基因串聯(lián)體得到融合表達(dá)。 5、表達(dá)的融合蛋白經(jīng)純化，然后用凝血酶和羥胺

6、對(duì)融合蛋白切割初步得到bLF pep、bLF pep突變體M1和突變體M2蛋白。通過(guò)抑菌圈實(shí)驗(yàn)，可以看到bLF pep和突變體M2蛋白表現(xiàn)出了對(duì)白色念珠菌ATCC64550的抑制活性。 結(jié)論：成功獲得了bLF pep、bLF pep突變體M1和突變體M2基因二拷貝同向串聯(lián)體；并構(gòu)建了bLF pep、bLF pep突變體M1和突變體M2二拷貝基因重組質(zhì)粒；bLF pep、bLF pep突變體M1和突變體M2二拷貝基因的融合表達(dá)獲得