核因子-κB在去甲斑蝥素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡中的作用.pdf

1、原發(fā)性肝癌主要由肝細(xì)胞癌(HCC)組成，是世界上人類最常見的惡性腫瘤之一，預(yù)后極差，5年生存率不到9％，每年HCC相關(guān)死亡的數(shù)量超過600000。核因子-κB(Nuclearfactor-κappaB，NF-κB)是一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，存在于多種組織的多種細(xì)胞中，具有廣泛的生物學(xué)活性，激活后參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等多種生物進(jìn)程。近年的研究表明NF-κB與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、耐藥

2、、浸潤與轉(zhuǎn)移關(guān)系非常密切。去甲斑蝥素(norcantharidinNCTD)是從天然斑蝥分離出來的斑蝥素脫甲基而成，它具有抗腫瘤、升高白細(xì)胞、抗病毒及調(diào)節(jié)免疫等作用，比斑蝥素毒副作用更小。目前已用于治療原發(fā)性肝癌，食管癌等腫瘤的治療。但NCTD在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程中NF-κB通路的變化及對JNK影響國內(nèi)外少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察NCTD作用于肝癌細(xì)胞SMMC-7721對細(xì)胞形態(tài)、增殖與凋亡的影響，并觀察在加用NF-κB特異性抑制

3、劑吡咯烷二硫氨基甲酸鹽(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)前后NF-κB和JNK通路的變化，旨在探討NF-κB在肝癌細(xì)胞凋亡中的作用和意義及對JNK通路影響，從而進(jìn)一步闡明NCTD治療肝癌的機(jī)理，并為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。
　　 目的:本課題旨在通過不同濃度NCTD作用SMMC-7721來觀察其對肝癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響，并加用PDTC抑制NF-κB通路，探討NF-κB在NCTD誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞

4、凋亡中的作用和意義及對JNK通路的影響。
　　 方法:
　　 1、MTT法觀察不同濃度NCTD作用SMMC-7721后其對肝癌細(xì)胞增殖的影響。
　　 2、Hoechst33342染色通過對熒光顯微鏡下形態(tài)學(xué)變化的觀察研究NCTD對SMMC-7721凋亡的影響。
　　 3、流式細(xì)胞儀Annexin(V)-FITC/PI法檢測SMMC-7721細(xì)胞凋亡率來觀察NCTD對SMMC-7721凋亡的影響。
　

5、　 4、Westernblotting檢測細(xì)胞核NF-κBp65、胞漿IκBα、胍及pJNK蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、NCTD對SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響
　　 MTT法結(jié)果顯示，不同濃度NCTD(5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml)分別干預(yù)12h、24h、36h、48h后和對照組比較，A492值明顯下降，12h（0.599±0.02、0.585±0.

6、01、0.540±0.01、0.505±0.01、0.428±0.01）和對照組（0.635±0.01）;24h（1.068±0.08、1.053±0.09、0.961±0.01、0.878±0.11、0.699±0.12）和對照組（1.218±0.07）;36h（0.582±0.01、0.533±0.01、0.506±0.02、0.400±0.03、0.283±0.02）和對照組(0.720±0.02);48h（0.699±0.06、

7、0.595±0.02、0.510±0.06、0.435±0.04、0.252±0.03）和對照組（0.885±0.07），均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明NCTD對SMMC-7721增殖有抑制作用，具有劑量依賴的特點(diǎn)(Table1)。
　　 增殖抑制率結(jié)果顯示，不同濃度NCTD(5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml)分別干預(yù)12h、24h、36h、48h后和對照組比較，12h（5.63

8、±0.10、7.97±0.14、15.22±0.66、20.56±0.89、32.66±1.51）和對照組(0);24h（11.47±0.72、13.86±0.83、21.78±1.26、27.09±0.94、43.30±0.09）和對照組(0);36h(19.32±0.94、25.51±1.06、29.58±1.48、44.30±1.35、59.30±1.37)和對照組(0);48h（21.28±1.15、33.20±1.30、42.

9、40±1.31、50.91±1.32、70.74±0.83）和對照組(0)，均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），且不同時(shí)間不同濃度NCTD組間比較(P＜0.05）亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明NCTD對SMMC-7721增殖有抑制作用，具有時(shí)間和劑量依賴的特點(diǎn)(Fig.1，Table2)。
　　 2、通過對熒光顯微鏡下形態(tài)學(xué)變化的觀察研究NCTD對SMMC-7721凋亡的影響
　　 Hoechest33342染色結(jié)果顯示對照組細(xì)胞大小

10、均勻，NCTD干預(yù)后，細(xì)胞核出現(xiàn)濃縮、凋亡小體出現(xiàn)。40ug/mlNCTD干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞12h、24h、36h、48h后凋亡率（11.21±0.20％、19.83±0.76％、28.00±1.00％、34.13±1.00％）依次升高，與對照組（4.33±0.15％）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)組間比較亦具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明NCTD可誘導(dǎo)SMMC-7721凋亡，隨作用時(shí)間的延長凋亡率升高，具有時(shí)間依賴的特點(diǎn)。

11、（見Fig.2，Table3）
　　 3、通過流式Annexin(V)-FITC/PI法檢測SMMC-7721細(xì)胞凋亡率觀察NCTD對SMMC-7721凋亡的影響，并觀察NF-κB在NCTD誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡中的作用。
　　 結(jié)果顯示NCTD干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞48h后，各干預(yù)組(5ug/mlNCTD、20ug/mlNCTD、40ug/mlNCTD、PDTC、PDTC+40ug/mlNCTD)SMMC-

12、7721凋亡率（13.27±0.56％、36.80±0.36％、43.17±0.55％、17.53±0.52％、50.23±1.35％）和對照組（5.70±0.20％）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。不同濃度NCTD（5ug/ml、20ug/ml、40ug/ml）組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明NCTD誘導(dǎo)SMMC-7721凋亡具有濃度依賴的特點(diǎn)。PDTC組（17.53±0.52％）凋亡率與對照組（5.70±0.20％）比較

13、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，說明抑制NF-κB通路可誘導(dǎo)凋亡，并且PDTC+40ug/mlNCTD組（50.23±1.35％）較40ug/mlNCTD組（43.17±0.55％）細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加，兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明NCTD通過抑制NF-κB通路活性誘導(dǎo)SMMC-7721凋亡。(Fig3，Table4)。
　　 4、Westernblot法檢測去甲斑蝥素作用SMMC-7721后及加用PDTC前后NF

14、-κBp65、IκBα、JNK及pJNK蛋白的表達(dá)
　　 不同組別NCTD(5ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、PDTC、PDTC+40ug/mlNCTD)作用于SMMC-7721細(xì)胞48小時(shí)后，低、中、高濃度組(5ug/ml、20ug/ml、40ug/ml)核蛋白NF-κBp65(1.85±0.01、1.74±0.01、1.42±0.01)及胞漿IκBα蛋白（1.34±0.01、1.20±0.02、0.85±0.01

15、）的表達(dá)依次下降，pJNK蛋白（1.54±0.01、1.72±0.01、1.82±0.01）的表達(dá)依次升高，各濃度組間相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);且與空白對照組NF-κBp65、IκBα及pJNK蛋白的表達(dá)（2.02±0.01、1.55±0.01、1.36±0.01）相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;而JNK低、中、高濃度組(1.98±0.01、1.98±0.01、1.98±0.01)的蛋白表達(dá)組間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)

16、，與空白對照組（1.98±0.01）相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明NCTD對SMMC-7721核蛋NF-κBp65、胞漿IκBα及pJNK蛋白表達(dá)有影響，且有濃度依賴性，隨著藥物濃度的增高，NF-κB通路抑制和JNK通路激活作用增強(qiáng)。
　　 對照組與PDTC組核蛋白NF-κBp65（2.02±0.01、1.63±0.01）及胞漿IκBα蛋白（1.63±0.01、1.55±0.01）的表達(dá)明顯下降，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

17、＜0.05)，說明PDTC明顯阻斷了NF-κB活性。PDTC+40ug/mlNCTD組和40ug/mlNCTD組核蛋白NF-κBp65（1.06±0.01、1.42±0.01）及胞漿IκBα蛋白（0.62±0.01、0.85±0.01）相比進(jìn)一步下降，pJNK蛋白（1.82±0.01、2.12±0.01）進(jìn)一步上升，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;而JNK（1.98±0.01、1.98±0.01）的蛋白表達(dá)組間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

18、＞0.05），這說明在NCTD誘導(dǎo)SMMC-7721凋亡過程中NF-κB抑制可能對JNK有激活作用(Fig4.1、4.2、4.3、4.4、Tabe5)。
　　 結(jié)論:
　　 1、體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，去甲斑蝥素可抑制SMMC-7721的增殖，其抑制作用具有一定時(shí)間和劑量依賴性。
　　 2、去甲斑蝥素可誘導(dǎo)SMMC-7721凋亡。
　　 3、SMMC-7721細(xì)胞中的NF-κB通路可以被去甲斑蝥素抑制，進(jìn)而