樹(shù)突狀細(xì)胞基因表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定關(guān)系的研究.pdf

1、冠心病(coronary heart disease，CHD)作為進(jìn)入二十世紀(jì)以來(lái)，威脅人類生命健康的主要疾病，其有效防治一直成為整個(gè)社會(huì)關(guān)注的重點(diǎn)和難點(diǎn)。 本文就樹(shù)突狀細(xì)胞基因表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定關(guān)系進(jìn)行了研究，全文分為三個(gè)部分，將分離的臨床病例外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和血清為研究對(duì)象，以研究外周血PBMC源性DCs基因表達(dá)和功能變化是否介入冠心病發(fā)

2、生發(fā)展為切入點(diǎn)，通過(guò)免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、基因芯片、RT-PCR和ELISA等方法，重點(diǎn)觀察外周血PBMC源性DCs的成熟，狀態(tài)、免疫功能和其他基因表達(dá)的差異與AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，深入探討抗原呈遞細(xì)胞功能變化在AS演變不同階段的地位和作用。旨在為AS發(fā)生發(fā)展的免疫介導(dǎo)學(xué)說(shuō)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和免疫治療途徑，為心腦血管疾病的防治提供新的理論平臺(tái)和技術(shù)手段，具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和重要的社會(huì)意義。結(jié)果分述如下： 1．ACS患者外周血來(lái)源的DCs

3、處于成熟狀態(tài)，并具有誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的能力1．1各組患者一般臨床資料情況比較無(wú)顯著性差異臨床入選病例總共81例，其中AMI組20例、UAP組20例、SAP組20例、CPS組11例、對(duì)照組10例)一般臨床資料的比較顯示：各組的年齡、性別比例相比差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。各組中主要的心血管病危險(xiǎn)因素，如：吸煙(Smolking)、高血壓(Hypertension)、糖尿病(Diabetes mellitus)、總膽固醇(Total c

4、holester01)、甘油三脂(Triglyceride)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL cholesterol)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL cholesterol)等，相互之間的比較差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)； 1．2體外誘導(dǎo)PBMC來(lái)源的DCs，流式細(xì)胞儀鑒定DCs細(xì)胞表型： 倒置相差顯微鏡下的形態(tài)：培養(yǎng)第3天可見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，由圓形變?yōu)椴灰?guī)則形，并長(zhǎng)出一些小刺狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞質(zhì)變得豐富。培養(yǎng)第5天，樹(shù)突樣結(jié)構(gòu)更

5、加明顯，胞質(zhì)更加豐富，細(xì)胞逐漸懸浮或半貼壁。培養(yǎng)到7天后，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，細(xì)胞開(kāi)始聚集成細(xì)胞團(tuán)，大部分懸浮或半貼壁，少數(shù)貼壁。臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活力大于96％。流式細(xì)胞儀檢測(cè)人外周血PBMC來(lái)源的DCs表型為CD1α<'+>，CD80<'+>，CD83<'low>，CD86<'+>，HLA-DR<'+>； 1．3與自身血漿共同培養(yǎng)DCs上清液細(xì)胞因子IL-12檢測(cè)結(jié)果： 正常對(duì)照組、CPS組、SAP組、UAP組和AMI組

6、上清液的IL-12表達(dá)量12小時(shí)樣本測(cè)的分別為19.46±6.83，27.964±9.16，24.234±7.72，59.9±24.00和68.5±16.5pg/ml，24小時(shí)樣本測(cè)的分別為45.84±17.64，49.04±16.62，52.1±16.55，129.41±46.60和130.86±30.68pg/ml和48小時(shí)測(cè)的分別為50.68±16.7，59.93±16.37，57.84±16.36，151.43±43.79和15

7、3.95±27pg/ml，IL-12在五組間差異有顯著性意義(均P<0.001)。LSD比較分析表明，UAP組和AMI組比正常對(duì)照組、CPS組和SAP組DCs上清培養(yǎng)液中IL-12濃度在12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)都升高； 1．4各組DCs與自身血漿共孵育后FACS分析DCs表型變化情況： 正常對(duì)照組、CPS組、SAP組、UAP組和AMI組PBMC來(lái)源的DCs細(xì)胞表面CD1α表達(dá)比例分別為11.084±3.82％，12.

8、28+3.91％，13.71+5.53％，20.09+4.9％和20.57+4.75％。CD80比例分別46.784±16.86％，48.51±14.75％，46.81±15.92％，61.39±11.49％和60.91±17.77％。CD83比例分別為47.57±12.34％，46.59±10.22％，45.76±14.11％，54.17±16.41％和51.31±18.8％。CD86比例分別為46.83±7.45％，46.08±10

9、.25％，45.76±17.75％，62.27±14.01％和67.98±17.03％。HLA-DR比例分別為79.01±11.05％，73.77±13.55％，72.16±17.11％，74.13±12.27％和79.23±9.79％。其中，CD1α、CD80和CD86等表型五組間比較差異有顯著性意義(F<,CD1>=13.4、F<,CD80>=4.138和F<,CD86>=8.672，均P<0.05)。LSD比較分析表明，UAP組和

10、AMI組比正常對(duì)照組、CPS組和SAP組CD1α、CD80和CD86表型表達(dá)細(xì)胞比例增加(均P<0.05)； 1．5各組患者DCs的同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)： 正常對(duì)照組、CPS組、SAP組、UAP組和AMI組PBMC來(lái)源的DCs細(xì)胞與同種T淋巴細(xì)胞共孵育，在DCs細(xì)胞數(shù)與T細(xì)胞比例為1∶50時(shí)各組<'3>H-TDR摻入率分別為1035.8±280.9，1054±247.39，1112.4±319.9、2633.6±426.

11、1和2660.4±316.02cpm/2000cells；在DCs細(xì)胞數(shù)與T細(xì)胞比例為1∶20時(shí)各組<,3>H-TDR摻入率分別為2043.8±303.5，2169.55±311.6，2139±295.1、5122.3±640.4和5069.1±748.9cpm/2000cells。<'3>H-TDR摻入率在五組間存在顯著性差異(F<,1∶50>=110.06和F<,1∶20>=155.2，P<0.001)。LSD比較分析表明，UAP組

12、和AMI組在<'3>H-TDR摻入率較其他三組差異有顯著性意義(P<0.001)；而正常對(duì)照組、CPS組和SAP組之間<'3>H-TDR摻入率差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)；而且，DCs在與T淋巴細(xì)胞1∶50混合時(shí)UAP組和AMI組<'3>H-TDR摻入率都明顯增加； 2．基因芯片檢測(cè)外周血PBMC來(lái)源的DCs基因表達(dá)不同 芯片檢測(cè)的結(jié)果顯示，ACS患者組功能蛋白表達(dá)基因中有5個(gè)基因呈明顯上升，分別是G1P2、G1P3

13、、IFIT4、IL-1β和MX1，這些都是高度相關(guān)的干擾素誘導(dǎo)蛋白基因。有17個(gè)基因呈明顯下降表達(dá)，分別是ACPP、AIM2、ATM、CCR1，CCR5，CD1C，F(xiàn)CGR3A，IF116、IL-16，IL-18、LY75、MAP4K3，TAP1，TAP2、TLRl、TNFRSF6和VCL等，分別屬于抗原識(shí)別受體、細(xì)胞趨化因子受體、細(xì)胞因子和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。如前所述，成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞其抗原識(shí)別和攝取功能下降，而抗原提呈功能增強(qiáng)；最初

14、為有關(guān)抗原加工的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)減少；而與抗原呈遞相關(guān)的蛋白表達(dá)應(yīng)該增多。我們的研究表明ACS患者外周血PBMC來(lái)源的DCs分別在抗原識(shí)別方面的受體如TLR1和FCGR3A等表達(dá)減低；而負(fù)責(zé)傳輸特異性抗原肽結(jié)合到MHC分子的TAP1和TAP2蛋白基因表達(dá)也同樣下降；而CCR1和CCR5這兩個(gè)趨化因子受體同樣是具有趨化DCs遷徙到抗原所在區(qū)域的作用，在DCs成熟時(shí)則表達(dá)下降；而與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)高度相關(guān)的蛋白(如：MAP4K3)和某

15、些細(xì)胞因子(如：IL-16和IL-18基因)表達(dá)下降則可能與DCs細(xì)胞信號(hào)自身傳導(dǎo)和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)變化相關(guān)。 3．熒光定量PCR檢測(cè)基因芯片結(jié)果，顯示DCs基因芯片檢測(cè)有較好的可信度 應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)芯片檢測(cè)表達(dá)上調(diào)的基因MX1和IL-1β，以及表達(dá)下調(diào)的基因FIF16表達(dá)情況顯示，ACS患者M(jìn)X1和IL-1β基因表達(dá)較對(duì)照組增加幅度與基因芯片檢測(cè)相似；而：FIF16基因表達(dá)較對(duì)照組降低加幅度與基因芯片檢測(cè)相似。

16、 通過(guò)上述三個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)，能夠得出以下結(jié)論：①ACS患者外周血PBMC源的DCs細(xì)胞表型表達(dá)處于成熟狀態(tài)，ACS患者體：DCs處于成熟活化狀態(tài)；②ACS患者外周PBMC來(lái)源的DCs，分泌IL-12水平較對(duì)照組明顯升高，且具有誘導(dǎo)同種T淋巴細(xì)胞增殖的能力；③ACS患者組功能蛋白表達(dá)基因中有5個(gè)基因呈明顯上升，分別是G1P2、G1P3、IFIT4、IL-1β和MX1，這些都是高度相關(guān)的干擾素誘導(dǎo)蛋白基因。有17個(gè)基因呈明顯下降表達(dá)，分