黃芪多糖干預樹突狀細胞基因表達與動脈粥樣硬化斑塊關(guān)系的研究.pdf

1、近年來，隨著急性冠脈綜合癥這個CHD的急性進展階段的界定，使得人們重新認識了CHD發(fā)展階段的病理和病理生理特點。研究發(fā)現(xiàn)ACS的病理基礎是易損斑塊，并且發(fā)現(xiàn)易損斑塊伴隨著大量炎癥細胞和免疫細胞的介入，是斑塊不穩(wěn)定和容易破裂的主要原因；ACS患者存在全身炎癥因子和炎癥反應活化的情況。進而，發(fā)現(xiàn)AS的所有階段都有免疫細胞的介入，提出CHD是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病這一新觀點，認為內(nèi)在或外在危險因素導致的炎癥和免疫反應是AS發(fā)病的基礎。

2、 樹突狀細胞是免疫過程中起負責抗原呈遞的細胞，是機體內(nèi)功能最強的專職抗原呈遞細胞。極少量的DCs即可強烈激活T淋巴細胞啟動特異性細胞免疫反應，其激活T淋巴細胞的能力是巨噬細胞或B細胞的100～1000倍，在免疫應答的誘導和調(diào)節(jié)中起重要作用。最近的研究顯示氧化修飾的低密度脂蛋白和尼古丁可通過激活DCs介導的獲得性免疫反應，促進AS病變的進展。說明DCs可能參與了AS的病理發(fā)生，在觸發(fā)和放大AS炎癥免疫反應中起重要的調(diào)節(jié)作用。

3、 黃芪多糖是黃芪中重要的天然有效成分之一，具有雙向調(diào)節(jié)血糖、促進免疫、提高巨噬細胞活性、促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化，激活T細胞B細胞并能促進抗體的形成，從而抗擊各種病毒性和細菌性疾病，此外，研究發(fā)現(xiàn)APS在多種疾病中發(fā)揮重要作用，如APS具有抗腫瘤作用，但體外實驗表明APS不能有效抑制腫瘤細胞生長，推測其抗腫瘤作用可能與APS的免疫誘導作用有關(guān)。APS可顯著降低非肥胖小鼠1型糖尿病的發(fā)病率，保護胰腺小島的超微結(jié)構(gòu)，恢復Th1細胞群和Th2細胞群間

4、平衡。APS能夠降低SD大鼠腎皮質(zhì)NF-κB mRNA水平的表達，提高IκB mRNA的表達，可有效的防治糖尿病腎病的進展。APS能夠有效抑制金屬誘導的氧化應激，抑制腎臟的缺血再灌注損傷，調(diào)控免疫反應，抑制腎小球系膜細胞增殖和基質(zhì)的過度合成以及下調(diào)腎小球系膜細胞β1整合素的表達。在心血管疾病相關(guān)研究中，APS能有效降低健康人總膽固醇、載脂蛋白H、低密度脂蛋白的水平，對50歲以上中老年健康人群的三酰甘油水平也同樣有效。在對糖尿病心肌病倉鼠

5、模型的研究中，APS通過抑制倉鼠局部心肌糜蛋白酶-Ang Ⅱ系統(tǒng)發(fā)揮抗倉鼠糖尿病心肌病的作用。此外，有研究表明APS是通過抑制血小板鈣調(diào)蛋白而抑制磷酸二酯酶的活性，從而增加血小板內(nèi)cAMP含量，抑制血小板聚集和血栓形成。此外，APS是黃芪注射液的主要成分之一，在對冠心病心絞痛的治療中，黃芪注射液能明顯減少心絞痛的發(fā)作次數(shù)，延長發(fā)作間歇時間，臨床療效改善顯著。黃芪注射液能夠干預CHD發(fā)生發(fā)展可能與APS的免疫調(diào)節(jié)功能密不可分。 由

6、于DCs作為聯(lián)系天然防御功能和獲得性免疫的關(guān)鍵，與CHD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，那么在CHD治療中，APS是否通過作用于DCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能？APS處理后具有抗原呈遞功能的DCs功能狀態(tài)如何，是否會影響其功能蛋白和免疫調(diào)節(jié)分子的分泌，是否會影響這些蛋白的基因表達。這些問題中，研究APS處理后DCs的基因變化是問題關(guān)鍵。 本課題分為三個部分，將分離的臨床人外周血單核細胞和血清為研究對象，以研究APS處理后外周血PBMC源性DCs基因表

7、達和功能變化為切入點，通過免疫熒光、流式細胞術(shù)、基因芯片、RT-PCR和ELISA等方法，重點觀察APS處理外周血PBMC源性DCs的成熟狀態(tài)、免疫功能和其他基因表達的差異與AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，深入探討APS處理后抗原呈遞細胞功能變化在AS治療過程的地位和作用。旨在為AS發(fā)生發(fā)展的免疫介導學說提供實驗依據(jù)和免疫治療途徑，為心腦血管疾病的防治提供新的理論平臺和技術(shù)手段，具有長遠的經(jīng)濟價值和重要的社會意義。結(jié)果分述如下： 1.APS

8、處理后人外周血來源的DCs處于成熟狀態(tài)，并具有誘導T細胞增殖的能力。 1.1 人外周血來源的DCs培養(yǎng)與鑒定。 培養(yǎng)第2天對照組細胞粘附于聚苯乙烯培養(yǎng)瓶底部，實驗組的細胞部分在培養(yǎng)基中懸浮生長，細胞較小，形態(tài)無明顯差別。培養(yǎng)第6天對照組的細胞呈圓形或橢圓形，大部分粘附于培養(yǎng)瓶瓶底；LPS組、100mg/L APS組的細胞生長狀態(tài)最好，呈懸浮生長，可見部分細胞聚集成簇，細胞表面可見數(shù)量不等、形態(tài)不一的樹突樣突起。200mg

9、/L APS組多數(shù)細胞胞質(zhì)內(nèi)可見大量空泡樣結(jié)構(gòu)，可見細胞崩解，有大量不定型的細胞碎片。流式細胞儀檢測APS100mg/L組人外周血PBMC來源的DCs表型為CD1 α+，CD80+，CD83low，CD86+，HLA-DR+。 1.2 DCs培養(yǎng)上清液細胞因子IL-12檢測結(jié)果。 因200mg/L組細胞大量凋亡崩解，故選擇對照組、LPS組、50mg/L APS組、100mg/L APS組細胞上清液中IL-12進行檢測。培

10、養(yǎng)6天后，4組細胞上清液中IL-12含量存在顯著性差異（P=0.000）；其中， LPS組、100mg/L APS組細胞上清液中IL-12含量分別與對照組、50mg/L APS組相比存在顯著性差異（P=0.000），明顯高于后兩組。 1.3 各組外周血PBMC來源的DCs表型變化情況。 選擇對照組、50mg/L APS組、100mg/L APS組、LPS組進行流式細胞學檢測。100mg/L APS組、LPS組DCs表面C

11、D1 α、CD86等表型表達上調(diào)，與對照組、50mg/L APS組相比，存在顯著性差異（P<0.05）；LPS組HLA-DR表達與50mg/L APS組相比，存在顯著性差異（P<0.05），50mg/L APS組HLA-DR表達較低。而各組DCs表面CD83表型表達各組之間差異無顯著性意義。 1.4 各組DCs的同種混合淋巴細胞反應。 3H-TDR摻入率在4組間存在顯著性差異（P<0.01）。DCs在與T淋巴細胞混合比例

12、在1：50、1：20時，100mg/L APS組、LPS組的3H-TDR摻入率與其他兩組相比，存在顯著性差異（P<0.01），較其余兩組明顯升高；而對照組、50mg/LAPS組之間的3H-TDR摻入率相比，無顯著性學差異（P>0.05）。 2.基因芯片檢測外周血PBMC來源的DCs基因表達不同。 芯片檢測的結(jié)果顯示，APS處理后人外周血DCs功能蛋白表達基因中有7個基因呈明顯上升，分別是CD36、IGSF6、IL27、I

13、NHA、LIPA、MAP4K3和SOD2，分別屬于抗原識別受體、細胞因子、細胞酶類和細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)。有26個基因呈明顯下降表達，分別是ADAM19、ADAR、BASP1、BTG1、CCR7、CD40LG. CST7、CXCL9. CXCR4. DCTN2、 EBI3、ISG15. ICAM1、IFI16、IL15、ISG20、CD207、LTA、MARCKS、MARCKSL1.、NFKB1、 NFKB2、PNRC1、RAC1、REL

14、B和TNFRSF11B等，分別屬于細胞酶類、抗原識別受體、細胞趨化因子受體、細胞因子和細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)。APS處理后人外周血PBMC來源的DCs分別在細胞粘附及趨化DCs遷徙的受體及相關(guān)蛋白如ADAM19、CCR7、CD40LG、CST7、CXCL9和CXCR4等的表達減低；而與誘導細胞增殖及活化相關(guān)的信號傳導通路及功能蛋白的基因表達如ADAR、BASP1、BTG1、DCTN2、ISG15、ISG20、 MARCKS、 MARCKSL

15、1、NFKB1、NFKB2、 PNRC1、RAC1、RELB和TNFRSF11B也同樣下降；而與抗原呈遞及誘導免疫反應相關(guān)蛋白的基因表達如EBI3、IFI16、IL15、CD207和LTA等表達下降。而作為升高的表達基因，有抗原結(jié)合蛋白基因如CD36；有消化及降解抗原的相關(guān)細胞及溶酶體酶類蛋白如LIPA和SOD2；同樣有抑制炎癥及免疫反應的蛋白基因表達增多，如IL27和INHA等。 3.熒光定量PCR檢測基因芯片結(jié)果，顯示DCs

16、基因芯片檢測有較好的可信度。 應用熒光定量PCR檢測芯片檢測表達上調(diào)的基因CD36和IL-27，以及表達下調(diào)的基因FIF16表達情況顯示，APS處理后DCs組CD36和IL-27基因表達較對照組增加幅度與基因芯片檢測相似；而FIF16基因表達較對照組降低加幅度與基因芯片檢測相似。 通過上述三個部分的實驗，能夠得出以下結(jié)論： ①APS處理人外周血PBMC源的DCs細胞形態(tài)及表型表達處于成熟狀態(tài)； ②APS處

17、理人外周血PBMC源的DCs，分泌IL-12水平較對照組明顯升高，且具有誘導同種T淋巴細胞增殖的能力； ③APS處理后人外周血DCs功能蛋白表達基因中有7個基因呈明顯上升，分別是CD36、IGSF6、IL27、INHA、LIPA、MAP4K3和SOD2，分別屬于抗原識別受體、細胞因子、細胞酶類和細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)。有26個基因呈明顯下降表達，分別是ADAM19、ADAR、BASP1、BTG1、CCR7、CD40LG、CST7、C

18、XCL9、CXCR4、DCTN2、EBI3、ISG15、ICAM1、IFI16、IL15、ISG20、CD207、LTA、MARCKS、MARCKSL1、NFKB1、NFKB2、PNRC1、RAC1、RELB和TNFRSF11B等，分別屬于細胞酶類、抗原識別受體、細胞趨化因子受體、細胞因子和細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)。 ④熒光定量PCR檢測芯片檢測表達上調(diào)的基因CD36和IL-27，以及表達下調(diào)的基因IFI16表達情況，驗證了芯片檢測的