中華倒刺鲃胰蛋白酶的cDNA克隆與序列分析.pdf

1、胰蛋白酶(Trypsin)是動(dòng)物消化道中一種主要的堿性蛋白水解酶，屬于絲氨酸蛋白酶家族，專一性水解賴氨酸或精氨酸羧基形成的肽鍵。其主要功能一是消化蛋白質(zhì)食物，二是激活所有胰腺分泌的酶原，它可以有力迅速地激活其他蛋白酶原(糜蛋白酶原、羧肽酶原、彈性蛋白酶原)而行使消化功能。在脊椎動(dòng)物中，由胰臟的腺泡細(xì)胞的核糖體產(chǎn)生無(wú)活性的前體——胰蛋白酶原(Trypsinogen)再進(jìn)入胰腺運(yùn)輸管，最后釋放到腸腔，在那里被腸黏膜細(xì)胞分泌的腸激酶活化而生成

2、有活性的胰蛋白酶。通過(guò)比較不同動(dòng)物編碼胰蛋白酶的mRNA序列，可以了解其胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及與功能之間的關(guān)系，進(jìn)而揭示不同動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)消化能力差異的原因。本研究對(duì)中華倒刺鲃胰蛋白酶原mRNA進(jìn)行了克隆和序列測(cè)定，并對(duì)其核苷酸序列及推導(dǎo)氨基酸序列以及預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，主要研究結(jié)構(gòu)如下： 1中華倒刺鲃胰蛋白酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列在對(duì)多種硬骨魚(yú)類的胰蛋白酶基因進(jìn)行了多重比對(duì)后設(shè)計(jì)了2個(gè)特異性3'RACE引物，以來(lái)自中

3、華倒刺鲃胰腺的mRNA為模板擴(kuò)增得到了中華倒刺鈀胰蛋白酶的3’端序列。根據(jù)得到的3’端序列設(shè)計(jì)了一個(gè)用于擴(kuò)增胰蛋白酶基因的中間片段的下游引物，又根據(jù)斑馬魚(yú)的胰蛋白酶基因序列設(shè)計(jì)了一個(gè)上游引物，從而得到了中華倒刺鲃胰蛋白酶的中間片段序列。再根據(jù)得到的中間片段序列設(shè)計(jì)了兩組5'RACE特異性引物，從而得到了中華倒刺鈀胰蛋白酶的5’段序列。 對(duì)所得到的三段序列進(jìn)行拼接，得到了中華倒刺鲃胰蛋白酶的cDNA序列，它全長(zhǎng)850bp，5’非編

4、碼區(qū)為29bp，編碼區(qū)包括738個(gè)核苷酸，編碼一個(gè)長(zhǎng)246個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)前體，3’非編碼區(qū)為80bp。 2中華倒刺鲃胰蛋白酶基因推導(dǎo)氨基酸序列的分析克隆得到的中華倒刺鲃胰蛋白酶的cDNA全長(zhǎng)850bp，包括一個(gè)5’非編碼物、一個(gè)編碼246個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框、TAA終止密碼子和一個(gè)包括加尾信號(hào)和poly(A)尾的3’非編碼區(qū)。編碼區(qū)核苷酸長(zhǎng)度為738bp，編碼246個(gè)氨基酸，由信號(hào)肽(14個(gè)氨基酸)、激活肽(8個(gè)氨基酸)、

5、催化三聯(lián)體氨基酸殘基(His-63，Asp-107,Ser-200)以及決定底物特異性的保守性天冬氨酸殘基(Asp-194)、12個(gè)半胱氨基酸殘基和聯(lián)接肽構(gòu)成。 3中華倒刺鲃胰蛋白酶基因推導(dǎo)蛋白的分析及其結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)預(yù)測(cè)胰蛋白酶基因編碼一個(gè)246個(gè)氨基酸的多肽鏈，分子量Mw=26552Da，等電點(diǎn)pI=7.54。在氨基酸組成上，絲氨酸(Ser)含量最高，為11.79﹪；其次是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸及亮氨酸，分別為8.94﹪、8.13