加味補(bǔ)肝湯對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripberalneuropathy,DPN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見的慢性并發(fā)癥和致殘的主要因素之一。尋找有效的治療方法，是當(dāng)今國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，盡管。DPN在多元醇通路、晚期糖基化終末產(chǎn)物、蛋白激酶C通路和氨基已糖通路等引起DPN的分子機(jī)制研究有很大的進(jìn)展，但臨床應(yīng)用于針對(duì)上述途徑的藥物治療DPN仍不盡人意，最終治療DPN的策略必需從單一途徑回到整

2、體綜合方法。2001年，Browlee等提出的統(tǒng)一機(jī)制學(xué)說認(rèn)為，上述的四種假說可能均是高糖條件下，線粒體呼吸鏈中氧自由基生成過多所導(dǎo)致的結(jié)果。它把自由基對(duì)周圍神經(jīng)的損傷作為一個(gè)整體放在DPN的研究背景上，而不是從單一途徑。注重整體調(diào)節(jié)是中醫(yī)治療疾病的一大特色，中藥復(fù)方加味補(bǔ)肝湯經(jīng)多年的臨床觀察對(duì)DPN有顯著療效，在前期的實(shí)驗(yàn)研究中證明其具有抗氧化應(yīng)激的作用。本實(shí)驗(yàn)的目的是采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘發(fā)糖尿病模

3、型，觀察糖尿病大鼠機(jī)體和周圍神經(jīng)的氧化及抗氧化防御系統(tǒng)的變化，及其此變化與雪旺細(xì)胞和背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)元中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve Krowth factor，NGF)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶一3(caspase．3)的表達(dá)和細(xì)胞凋亡變化的關(guān)系。以期探討加味補(bǔ)肝湯保護(hù)糖尿病周圍神經(jīng)病變的可能作用機(jī)制，為其治療DPN提供理論依據(jù)。全文分兩部分。 方法： 第一部分：加味補(bǔ)肝湯對(duì)

4、糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的保護(hù)作用 (1)80只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、?；撬釋?duì)照組和加味補(bǔ)肝湯組，以STZ誘發(fā)糖尿病模型。(2)分別于治療前，治療后4周(4W)和8周(8W)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)尾靜脈采血測(cè)血糖值。(3)分別于治療后4W、8W兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，取坐骨神經(jīng)在光鏡和電鏡下行組織學(xué)觀察，并在處死之前檢測(cè)各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。 第二部分：加味補(bǔ)肝湯對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的保護(hù)作用機(jī)制研究

5、 (1)170只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、牛磺酸對(duì)照組和加味補(bǔ)肝湯組，以STZ誘發(fā)糖尿病模型。(2)分別于治療后4W、8W兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，應(yīng)用化學(xué)比色法，測(cè)定血清和坐骨神經(jīng)組織中丙二醛(malonaldehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量；用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)坐骨神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)中NGF、活化Caspase-3的蛋白表達(dá)；TJNEL法檢測(cè)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和坐骨神經(jīng)雪旺

6、細(xì)胞凋亡的情況；逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈反應(yīng)半定量分析坐骨神經(jīng)組織中NGF、Caspase-3mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 第一部分： (1)模型組血糖隨病程延長(zhǎng)有增高趨勢(shì)(P<0．01)。以加味補(bǔ)肝湯和牛磺酸干預(yù)后，在8W加味補(bǔ)肝湯組血糖與同期模型組比較有顯著性差異(P<0.01)。而加味補(bǔ)肝湯組在8W血糖水平與治療前比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。與同期模型組相比，加味補(bǔ)肝湯和?；撬釋?duì)體重?zé)o明顯改善。 (2)加

7、味補(bǔ)肝湯對(duì)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響：與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度在制模后4W、8W明顯減慢(均P<0．01)。經(jīng)加味補(bǔ)肝湯和?；撬岣深A(yù)后均能提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度，與同期模型組比較差異均有顯著性意義(P<0．05)。 (3)形態(tài)學(xué)觀察：與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組、?；撬釋?duì)照組和加味補(bǔ)肝湯組大鼠在4W、8W時(shí)均表現(xiàn)有明顯的損傷反應(yīng)，經(jīng)加味補(bǔ)肝湯和牛磺酸干預(yù)后病變程度明顯減輕，加味補(bǔ)肝湯組優(yōu)于?；撬釋?duì)照組。 第

8、二部分： (1)加味補(bǔ)肝湯對(duì)血清、坐骨神經(jīng)中MDA和GSH水平的影響：模型組4W、8W大鼠血清、坐骨神經(jīng)中MDA水平明顯高于同期正常對(duì)照組(P<0．01)，而GSH水平明顯低于同期正常對(duì)照組(P<0．01)。隨病程的延長(zhǎng)大鼠血清、坐骨神經(jīng)中MDA水平逐漸增加，而GSH水平在逐漸降低。與同期模型組相比，加味補(bǔ)肝湯能降低坐骨神經(jīng)和血清中MDA水平，提高GSt{水平(均P<0．05)，其結(jié)果與?；撬釋?duì)照組無顯著性差異(P>0．05)。

9、 (2)免疫組化及RT-PCR檢測(cè)顯示：在4W、8W模型組坐骨神經(jīng)和DRG神經(jīng)元中NGF的表達(dá)均較同期正常對(duì)照組明顯降低(P<0．01)，經(jīng)加味補(bǔ)肝湯和?；撬岣深A(yù)后其表達(dá)均較同期模型組明顯增強(qiáng)(P<0.05)，而加味補(bǔ)肝湯優(yōu)于?；撬幔?W時(shí)兩組比較差異顯著(P<0.05)；在正常鼠坐骨神經(jīng)和DRG神經(jīng)元中，未見活化Caspase-3的蛋白表達(dá)，而Caspase-3mRNA在正常組織中有極少量表達(dá)，4W、8W后模型對(duì)照組表達(dá)增加

10、，加味補(bǔ)肝湯和牛磺酸干預(yù)后其表達(dá)均較模型組表達(dá)明顯減少(P<0.05)，而加味補(bǔ)肝湯優(yōu)于?；撬?，在8W時(shí)兩組比較差異顯著(P<0.05)。 (3)TUNEL檢測(cè)：正常對(duì)照組坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞和DRG神經(jīng)元未見凋亡陽性細(xì)胞，在4W、8W后模型對(duì)照組有TUNEL陽性細(xì)胞，加味補(bǔ)肝湯和牛磺酸干預(yù)后陽性細(xì)胞減少(P<0.05)。 (4)經(jīng)Spearmans等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示：大鼠血清、坐骨神經(jīng)中GSH水平與血清和坐骨神經(jīng)中MDA、雪旺

11、細(xì)胞和DRG神經(jīng)元中Caslaase-3的表達(dá)及其凋亡呈負(fù)相關(guān)，與坐骨神經(jīng)和DRG神經(jīng)元中NGF的表達(dá)呈正相關(guān)。而血清和坐骨神經(jīng)中MDA水平與雪旺細(xì)胞和DRG神經(jīng)元中Caspase-3的表達(dá)及其凋亡呈正相關(guān)，與坐骨神經(jīng)和DRG神經(jīng)元中NGF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。 結(jié)論： 1．加味補(bǔ)肝湯具有減輕糖尿病模型大鼠周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的損傷，延緩神經(jīng)病變進(jìn)程的作用。 2．加味補(bǔ)肝湯可降低機(jī)體MDA水平，提高GSH水平，具有抗氧化