間充質(zhì)干細(xì)胞通過活化M2型巨噬細(xì)胞減輕急性腎損傷的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　橫紋肌溶解(rhabdomyolysis,RM)指任何原因引起的廣泛的橫紋肌細(xì)胞壞死,肌細(xì)胞內(nèi)容物外漏至細(xì)胞外液及血液循環(huán)中,導(dǎo)致急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)、電解質(zhì)紊亂等一系列并發(fā)癥,重癥患者預(yù)后極差。與肌紅蛋白尿相關(guān)的AKI是創(chuàng)傷和非創(chuàng)傷性橫紋肌溶解最嚴(yán)重的并發(fā)癥,現(xiàn)有治療無法根本改善其預(yù)后。如何提高RM后腎小管上皮細(xì)胞壞死的修復(fù)再生、降低AKI死亡率,一直是醫(yī)學(xué)界研究的重大課

2、題。近年來骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)在急慢性腎臟病中的應(yīng)用日益受到關(guān)注,給AKI的治療指明新的方向。多項研究均證實,MSCs治療可明顯改善腎小管損傷并有利于腎功能的恢復(fù)。巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞,可分為經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和替代性活化的M2型巨噬細(xì)胞兩種極性狀態(tài)。M2型巨噬細(xì)胞具有抑制炎癥反應(yīng),促進(jìn)組織重塑和再生修復(fù)的功能。體外研究中MSCs可與巨噬細(xì)胞相互作用,促進(jìn)M

3、2型巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生。那么,誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞的生成是否是MSCs減輕AKI的機(jī)制?目前尚無相關(guān)報道。本研究旨在建立RM所致AKI的小鼠動物模型,探討MSCs是否通過誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞的生成來減輕AKI,為闡明MSCs治療減輕AKI的機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　第一部分:C57BL/6小鼠經(jīng)雙下肢肌肉注射50％甘油8ml/kg建立RM所致AKI模型,觀察第6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h和168h

4、時間點血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和磷酸肌酸激酶(CK)的變化趨勢,以及腎臟、肌肉和肺臟的病理改變。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為Sham+生理鹽水(NS)組、Sham+MSCs組、RM+NS組和RM+MSCs組。6小時后,MSCs組給予1×106個紅色熒光蛋白(RFP)標(biāo)記的C57BL/6小鼠骨髓來源的MSCs尾靜脈注射, NS組給予等體積的生理鹽水尾靜脈注射;
　　(1)生化檢測血BUN、Cr和CK水平(n=10);

5、　　(2)酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和IL-10水平(n=5);
　　(3)光鏡觀察肌肉和腎臟病理損傷程度,計算腎小管壞死評分(n=4);
　　(4)PCNA免疫組化評價腎小管上皮細(xì)胞損傷后增殖情況(n=5);
　　(5)雙光子顯微鏡檢測RFP標(biāo)記的MSCs在RM模型小鼠各器官的定植情況(n=3)。
　　第二部分:C57BL/6小鼠經(jīng)50%甘油8ml/kg肌肉注射建立RM

6、模型,隨機(jī)分為RM+NS組和RM+MSCs組,n=5。取第24h、48h和72h的腎臟組織,免疫熒光技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞(F4/80)浸潤數(shù)量的變化和M2型巨噬細(xì)胞(CD206)浸潤數(shù)量的變化;Western Blot檢測橫紋肌溶解后不同時間點的腎臟組織M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206的表達(dá)水平。第24小時,Western Blot檢測sham+NS組、sham+MSCs組、RM+NS組和RM+MSCs組的M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206表達(dá)情

7、況。在損傷后第24小時,以MSCs治療的橫紋肌溶解AKI小鼠為研究對象,使用氯屈膦酸二鈉脂質(zhì)體清除其體內(nèi)的巨噬細(xì)胞,空白脂質(zhì)體作為對照,觀察兩組小鼠在第48h和72h血BUN、Cr和腎臟病理的改變。
　　第三部分:將小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞分為三組:常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞為M0組,脂多糖(LPS)2.5ug/ml刺激2h的細(xì)胞為M1組,LPS刺激后并與MSCs共培養(yǎng)72小時的細(xì)胞為M2組。使用細(xì)胞免疫熒光檢測三組細(xì)胞的巨噬細(xì)胞表

8、面標(biāo)志物F4/80和M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD206的表達(dá),流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組的CD206和IL-10表達(dá),ELISA檢測不同時間點培養(yǎng)液上清IL-6、TNF-α和IL-10的水平(n=5)。使用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體清除小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞,然后建立橫紋肌溶解AKI模型,并隨即尾靜脈注射1×107個M0組、M1組和M2組的RAW264.7細(xì)胞(n=5)。在AKI的第72h檢測血BUN、Cr和腎臟病理。
　　結(jié)果:
　　本研究第一

9、部分,成功建立了C57BL/6小鼠RM所致AKI模型,損傷后血BUN、Cr和CK進(jìn)行性升高,并觀察到CK于第24小時達(dá)峰值, BUN和Cr于第72小時達(dá)峰值的趨勢。第6h經(jīng)尾靜脈注射1×106個MSCs或等體積的NS對照,發(fā)現(xiàn)MSCs治療使RM小鼠血BUN、Cr和CK水平明顯下降(P<0.01),血促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的水平明顯下降(P<0.01),血抑炎細(xì)胞因子 IL-10的水平明顯升高(P<0.01)。腎組織 PAS染色

10、顯示RM+MSCs組的腎小管損傷減輕,腎小管壞死評分下降。PCNA免疫組化見RM+MSCs組的腎小管上皮細(xì)胞明顯增生。雙光子顯微鏡活體檢測MSCs主要定植在肺臟和肌肉,腎臟未發(fā)現(xiàn)RFP標(biāo)記的MSCs,并用組織免疫熒光證實。
　　本研究第二部分,組織免疫熒光發(fā)現(xiàn)RM發(fā)生后,腎臟的巨噬細(xì)胞浸潤逐漸增加,RM+MSCs組腎組織 CD206陽性的 M2型巨噬細(xì)胞提前出現(xiàn)。Western Blot證實RM+MSCs組腎臟M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物

11、CD206的表達(dá)水平顯著高于 RM+NS組(P<0.01),且表達(dá)在損傷后呈上升趨勢。不同組腎臟CD206表達(dá)分析發(fā)現(xiàn):損傷后第24小時,僅RM+MSCs組出現(xiàn)CD206的明顯表達(dá)(P<0.01)。MSCs治療 AKI小鼠的巨噬細(xì)胞清除實驗證實,在第24小時清除M2型巨噬細(xì)胞使第48h和72h小鼠的血BUN和Cr再次升高,伴腎臟損傷病理加重。
　　本研究第三部分,細(xì)胞免疫熒光檢測M0組、M1組及M2組的RAW264.7細(xì)胞均表達(dá)F

12、4/80,僅M2組高表達(dá)CD206。流式細(xì)胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)M2組的RAW264.7細(xì)胞高表達(dá)CD206和IL-10。ELISA測定RAW264.7培養(yǎng)液上清細(xì)胞因子濃度,LPS使IL-6和TNF-α的水平升高,MSCs使IL-6和TNF-α的水平降低、IL-10的水平升高(P<0.01)。氯屈膦酸二鈉脂質(zhì)體清除小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞后建立橫紋肌溶解AKI模型,空白脂質(zhì)體作為對照組,給予不同組巨噬細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移,損傷后第72小時發(fā)現(xiàn)接受M2組RA

13、W264.7細(xì)胞小鼠的血清BUN、Cr和病理損傷均較對照組、M0組和M1組明顯減低(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　(1)MSCs治療可調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥反應(yīng),減輕RM所致AKI;
　　(2) MSCs不通過直接定植于腎臟發(fā)揮保護(hù)作用;
　　(3)MSCs治療促進(jìn)腎臟M2型巨噬細(xì)胞浸潤的數(shù)量增加,清除巨噬細(xì)胞使已減輕的腎損傷再次加重;
　　(4)MSCs可在體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型的轉(zhuǎn)換。
　　(5)過繼