骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞減輕腹膜纖維化研究.pdf

1、背景:腹膜纖維化具有重要臨床意義。如慢性腹膜纖維化導(dǎo)致的超濾衰竭為終末期腎病(endstagerenaldisease，ESRD)患者腹膜透析(peritonealdialysis，PD)退出的重要原因，而急性腹膜纖維化導(dǎo)致的術(shù)后腹膜粘連可引起不育、腸梗阻。腹膜間皮細(xì)胞（peritonealmesothelialcells，PMCs）在維持腹膜穩(wěn)態(tài)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、炎癥、組織修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用。PMCs急性或慢性受損，可引起炎癥、腹膜纖維

2、化及粘連，同時(shí)在慢性刺激作用下部分PMCs從上皮細(xì)胞表型向間充質(zhì)細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)化即轉(zhuǎn)分化（epithelial-myofibroblasttransdifferentiation，EMT）亦可啟動(dòng)纖維化進(jìn)程，導(dǎo)致PD超濾失敗或術(shù)后腹膜粘連。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells，MSCs）可以通過(guò)定植、分化和/或分泌生物活性因子以促進(jìn)內(nèi)源性干/祖細(xì)胞遷移與分化、抑制炎癥、抗纖維化，從而促進(jìn)損傷的修復(fù)。目前尚無(wú)MSCs

3、與腹膜纖維化的研究。
　　 目的:本課題旨在明確1.MSCs能否通過(guò)促進(jìn)PMCs急性機(jī)械性損傷修復(fù)而減輕急性腹膜纖維化;2.MSCs能否通過(guò)抑制慢性腹膜透析中PMCs的EMT而減輕慢性腹膜纖維化。同時(shí)探討MSCs發(fā)揮療效的具體作用機(jī)制。
　　 方法:MSCs減輕急性腹膜纖維化的研究:建立腹膜機(jī)械性刮傷誘導(dǎo)的Sprague-Dawley(SD)大鼠急性腹膜粘連模型。刮傷后不同時(shí)間點(diǎn)，將5×106大鼠骨髓來(lái)源的紅色熒光蛋白(

4、redfluorescentprotein，RFP)-MSCs通過(guò)尾靜脈或腹腔注射入大鼠體內(nèi)，術(shù)后14d，采用腹膜粘連評(píng)分觀察腹膜粘連的嚴(yán)重程度、明確最佳注射方式與時(shí)間點(diǎn)。刮傷后24h，將5×106MSCs通過(guò)尾靜脈注射入體內(nèi)。術(shù)后采用腹膜粘連評(píng)分觀察腹膜粘連的嚴(yán)重程度，蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining，HE)觀察炎癥反應(yīng)，Masson三色染色觀察纖維化程度，免疫組織化學(xué)分析損傷腹膜區(qū)域中性粒細(xì)胞(

5、髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO))、單核巨噬細(xì)胞(ED-1)、成纖維細(xì)胞（成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1（fibroblastspecificprotein-1，F(xiàn)SP-1））數(shù)量及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1）水平，免疫組化分析間皮細(xì)胞（E-Cadherin）及免疫熒光分析間皮細(xì)胞、增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，P

6、CNA)，以觀察PMCs的修復(fù)及增殖。體外培養(yǎng)原代SD大鼠腹膜間皮細(xì)胞（ratperitonealmesothelialcells，RPMCs），利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)、通過(guò)計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞遷移速度、免疫熒光分析E-Cadherin及PCNA，觀察MSCs對(duì)機(jī)械性劃傷RPMCs修復(fù)的影響。近紅外線染料標(biāo)記的MSCs在腹膜刮傷后24h經(jīng)大鼠或重癥聯(lián)合免疫缺陷(serverecombinedimmune-deficiency，

7、SCID)小鼠尾靜脈或腹腔注射，采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)示蹤MSCs在體內(nèi)的分布。雙光子顯微鏡、免疫熒光分析MSCs在肺臟、脾臟等器官組織中的聚集、分布情況及其與巨噬細(xì)胞的定位關(guān)系。將5×106大鼠MSCs的無(wú)血清條件培養(yǎng)基(conditionedmedium，CM)超濾濃縮后，刮傷后24h、3d、5d通過(guò)尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)三次。術(shù)后采用腹膜粘連評(píng)分觀察腹膜粘連的嚴(yán)重程度，Masson三色染色觀察纖維化程度。采用抗體芯片技術(shù)檢測(cè)無(wú)血清饑

8、餓Oh、12h、24h的MSCs-CM，分析MSCs-CM中細(xì)胞因子分泌的變化，并對(duì)變化顯著的候選因子采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)驗(yàn)證。采用免疫熒光分析經(jīng)尾靜脈注射后在肺臟中或經(jīng)腹腔靜脈注射后在脾臟中積聚的MSCs的TSG-6表達(dá)情況，采用ELISA檢測(cè)大鼠血清TSG-6水平。腫瘤壞死因子α刺激基因6(tumornecrosisfactorα(TNFα)-stimul

9、atinggene-6,TSG-6)小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MSCs，RT-PCR與Westernblot檢測(cè)TSG-6-siRNA在MSCs中、ELISA檢測(cè)MSCs-CM中的干擾效果。腹膜刮傷后24h將MSCs、TSG-6-siRNAMSCs通過(guò)尾靜脈注射入大鼠體內(nèi);在腹膜刮傷后24h、3d、5d將MSCs-CM、TSG-6-siRNAMSCs-CM或重組小鼠TSG-6(recomb

10、inantmouseTSG-6，rmTSG-6)通過(guò)尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)三次。術(shù)后14d，采用腹膜粘連評(píng)分觀察腹膜粘連的嚴(yán)重程度，Masson三色染色觀察纖維化程度。體外利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)，通過(guò)計(jì)算細(xì)胞遷移速度、免疫熒光分析E-Cadherin及PCNA，觀察MSCs、TSG-6-siRNAMSCs及rmTSG-6對(duì)劃傷RPMCs修復(fù)的影響。
　　 MSCs減輕慢性腹膜纖維化的研究:建立慢性腹膜透析誘導(dǎo)的SD大鼠慢

11、性腹膜纖維化模型。在開(kāi)始腹膜透析液(4.25％)注射后不同時(shí)間點(diǎn)，將5×106MSCs通過(guò)尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)，28d采用Masson三色染色觀察腹膜纖維化程度，明確MSCs治療的最佳時(shí)間點(diǎn)。開(kāi)始腹膜透析液注射的即刻將5×106MSCs通過(guò)尾靜脈注射入體內(nèi)。28d檢測(cè)腹膜超濾功能及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量，采用Masson三色染色觀察腹膜纖維化程度，HE染色觀察腹膜血管密度，免疫組化分析腹膜區(qū)域PMCs（E-Cadherin）、肌成纖維細(xì)胞(smo

12、othmuscleactinα，α-SMA)數(shù)量及TGF-β1表達(dá)。
　　 結(jié)果:術(shù)后24h經(jīng)尾靜脈注射MSCs能減輕急性腹膜粘連程度，MSCs治療組腹膜粘連評(píng)分低于對(duì)照組，而腹腔注射療效不理想;MSCs治療組在術(shù)后反應(yīng)活躍期的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及滲出減少，成纖維細(xì)胞數(shù)量及TGF-β1水平減少，6d膠原纖維較少、厚度較薄、質(zhì)地較稀疏;反應(yīng)活躍期間皮細(xì)胞的數(shù)量增多、增殖活性增強(qiáng)。與MSCs共培養(yǎng)組細(xì)胞在劃傷后1h、2h的遷移速度增加，細(xì)

13、胞的增殖在劃傷后3h開(kāi)始增加，6h達(dá)到高峰，較對(duì)照組前移了6h。經(jīng)尾靜脈注射的MSCs主要在肺臟積聚，高峰在4h，熒光信號(hào)持續(xù)至少7d;經(jīng)腹腔注射的MSCs則主要在脾臟、肝臟積聚，高峰在24h，持續(xù)至少7d;但均未見(jiàn)到損傷腹膜區(qū)域內(nèi)有明顯的細(xì)胞積聚，甚至在SCID小鼠中經(jīng)腹腔注射仍未見(jiàn)腹膜區(qū)域內(nèi)有明顯的細(xì)胞積聚。雙光子顯微鏡及免疫熒光分析顯示，尾靜脈注射MSCs后4h，肺臟間質(zhì)中可見(jiàn)散在“栓子樣”MSCs，24h肺臟MSCs數(shù)量明顯下降

14、，但7d肺臟中仍可見(jiàn)少量MSCs，且多數(shù)未被巨噬細(xì)胞吞噬;經(jīng)腹腔注射MSCs后4h，脾臟中可見(jiàn)少量MSCs，且多數(shù)被巨噬細(xì)胞吞噬，24h后MSCs碎片明顯增多。尾靜脈注射無(wú)血清MSCs-CM能減輕急性腹膜粘連的程度，并與MSCs的療效相似。抗體芯片分析顯示，TSG-6因子的分泌在無(wú)血清饑餓MSCs的24h內(nèi)明顯增加。經(jīng)尾靜脈注射12h內(nèi)，在肺臟積聚的MSCs表達(dá)TSG-6，且尾靜脈注射MSCs4h，大鼠血清TSG-6的水平明顯升高，而經(jīng)

15、腹腔注射在脾臟積聚的MSCs不表達(dá)TSG-6，且血清TSG-6水平與對(duì)照組無(wú)差異。干擾TSG-6的表達(dá)、降低其分泌后，肺臟積聚留的MSCs無(wú)明顯TSG-6表達(dá)，血清TSG-6的水平無(wú)明顯升高，且TSG-6-siRNAMSCs、TSG-6-siRNAMSCs-CM對(duì)腹膜粘連的治療作用、TSG-6-siRNAMSCs對(duì)劃傷RPMCs遷移或增殖的促進(jìn)作用均減弱。而單獨(dú)采用rmTSG-6可以減輕腹膜粘連程度、促進(jìn)劃傷RPMCs的遷移及增殖。

16、r>　　 腹膜透析液開(kāi)始注射后即刻經(jīng)尾靜脈注射MSCs能明顯減輕慢性腹膜纖維化程度。28d后MSCs治療組腹膜超濾量、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量與正常組無(wú)差異，腹膜血管密度低于對(duì)照組，而腹膜化程度輕于對(duì)照組。7d后MSCs治療組腹膜區(qū)域間皮細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組，21d、28d肌成纖維細(xì)胞數(shù)量少于對(duì)照組，而28dTGF-β1水平低于對(duì)照組。
　　 結(jié)論:經(jīng)靜脈注射的MSCs能夠促進(jìn)RPMCs遷移與增殖能力、抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、減少成纖維細(xì)胞數(shù)量、