多巴胺D1類受體參與Th17細胞分化及急性哮喘發(fā)病機制的研究.pdf

1、支氣管哮喘是由多種炎癥細胞以及它們分泌的各種炎性因子參與的氣道慢性炎癥性疾病，伴有氣道高反應、粘液高分泌及可逆性氣流受限，晚期還可出現(xiàn)氣道重塑。Th2占優(yōu)勢的Th1/Th2失衡被傳統(tǒng)觀念認為是哮喘發(fā)病的免疫學機制。Th2細胞導致嗜酸細胞性哮喘(Eosinophilic asthma，EA)的發(fā)病。臨床上運用一線藥物糖皮質(zhì)激素和（或）β受體激動劑能夠控制絕大多數(shù)嗜酸性粒細胞哮喘患者的癥狀和提高他們的生活質(zhì)量。但部分患者卻表現(xiàn)出糖皮質(zhì)激素抵

2、抗，這類患者多為中性粒細胞性哮喘，且病情嚴重，已成為臨床研究的難點。因此這類患者的生理病理特點，疾病的發(fā)病機制，新的有效的治療靶點和方法成為近年來哮喘領域的研究熱點。
　　近年來新發(fā)現(xiàn)的Th17細胞，能很好地解釋“Th2理論”不能解釋的一些實驗和臨床現(xiàn)象。Th17細胞能夠分泌白細胞介素(interleukin-17，IL-17)。IL-17介導的信號途徑可誘導靶細胞產(chǎn)生多種炎癥因子刺激組織，能招募中性粒細胞在氣道局部聚集并激活，導

3、致組織浸潤和組織損害。糖皮質(zhì)激素不僅不能抑制中性粒細胞，反而能增加中性粒細胞的活性和生存周期。此外，IL-17還參與氣道重塑。已有文獻證實Th17/IL-17軸與哮喘的嚴重程度成正相關。綜上所述，進一步從分子水平探討Th17/IL-17軸，尤其是該軸的上游，有望進一步了解哮喘的發(fā)病機制，為尋找新的治療靶點提供理論依據(jù)。
　　多巴胺受體可分為D1類和D2類受體，多巴胺D1類受體與神經(jīng)和精神疾患的關系已有大量的研究，多巴胺D1類受體是

4、治療這些精神疾患的一個重要靶點。最近有研究發(fā)現(xiàn)多巴胺D1類受體還參與免疫疾病的發(fā)病機制。D1類受體拮抗劑可以抑制Th17和Th2細胞的分化，促進Th1細胞的分化，預防及治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）、治療非肥胖的糖尿病(non-obesity diabetes, NOD)小鼠、能減少小鼠腎毒性血清腎炎（nephrotoxic serum nep

5、hritis, NTN）新月體的形成，能減輕類風濕性關節(jié)炎中的炎癥反應，減少關節(jié)的損傷。因為Th2細胞和Th17細胞的過度活化及Th1細胞的抑制，參與哮喘的發(fā)病，所以，我們推測D1類受體可能通過影響Th17細胞而參與哮喘的發(fā)病。
　　首先我們通過分別用D1受體拮抗劑、激動劑和生理鹽水干預小鼠哮喘模型，觀察各組小鼠的一般行為活動，檢測肺功能，對支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)進

6、行細胞分類計數(shù)及檢測其IL-17的水平，觀察肺病理切片、用流式細胞術（flow cytometry）檢測脾臟CD4+T細胞中Th17細胞的比例，用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)檢測脾CD4+T細胞培養(yǎng)液上清液中IL-17的水平。通過這些指標來觀察D1受體拮抗劑和激動劑對哮喘小鼠的影響及在體內(nèi)對Th17/IL-17軸的影響。
　　我們進一步探討DI類受體影響Th

7、17細胞可能的信號通路。Nakagome K等認為可能是D1類受體激動后增加初始CD4+T細胞內(nèi)cAMP的濃度，促進Th17細胞的分化。此外，D1類受體影響DC分泌IL-23可能亦是其影響Th17細胞途徑之一。但環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)為什么能促進初始CD4+T細胞向Th17細胞分化？目前無相關報道。本實驗將探討cAMP促進初始CD4+T細胞向Th17細胞分化的信號通路。

8、　　D1類受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體(G-protein coupled receptor，GPCR)，它介導經(jīng)典信號通路Gs/AC/cAMP通路。Zhen等發(fā)現(xiàn)激動D1受體可增加胞內(nèi)cAMP的濃度，進而激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)。p38MAPK是細胞內(nèi)信息傳遞的交匯點和共同通路，可激活核轉(zhuǎn)錄因子kB(nuclearfactor-kappa b，N

9、F-kB)。NF-kB是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可控制BATF基因的轉(zhuǎn)錄。
　　BATF(B cell activating transcription factor)是近期發(fā)現(xiàn)的AP-1(activator protein1)家族新成員。BATF是Th17細胞不可缺少的一個核轉(zhuǎn)錄因子，它參與RORα和RORγt表達的維持，并且通過直接結(jié)合在IL-17基因的啟動子上，和RORγt協(xié)同誘導IL-17的表達?；谏鲜觯覀兇竽懲茰y

10、，D1類受體可通過調(diào)控BATF促進Th17細胞的分化。
　　本研究將在體外探討D1類受體是否通過調(diào)控BATF促進Th17細胞的分化。首先分離、純化正常小鼠脾源性CD4+T細胞并予Th17細胞定向分化的環(huán)境，同時分別用D1類受體拮抗劑和激動劑干預。定向分化3天后，用流式細胞術檢測Th17細胞的比例，ELISA檢測培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度，免疫蛋白印跡(western blot，WB)檢測RORγt和BATF的表達。探討了D1類受

11、體對Th17細胞分化及對BATF表達的影響后，用BATF小干擾RNA(short interferingRNA，siRNA)和對照siRNA(即無干擾效果的siRNA)轉(zhuǎn)染兩組小鼠脾CD4+T細胞，再予Th17細胞定向分化的壞境，同時加入D1類受體激動劑。培養(yǎng)分化細胞后，用WB檢測BATF的表達，評估用siRNA轉(zhuǎn)染細胞后，BATF的沉默效果。在檢測到BATF的沉默效果佳后，用流式細胞術檢測Th17細胞的比例，WB檢測RORγt的表達，

12、ELISA檢測培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度，觀察D1類受體激活后，BATF基因部分沉默和正常表達時Th17細胞的分化情況，以期闡明D1類受體影響Th17細胞分化的信號通路。
　　第一章多巴胺D1類受體對急性哮喘氣道炎癥及Th17/IL-17軸的影響
　　目的：
　　(1)建立急性哮喘小鼠模型，并鑒定建立的模型是否成功;
　　(2)觀察D1類受體拮抗劑和激動劑對急性哮喘小鼠氣道炎癥及Th17/IL-17軸的影響。<

13、br>　　方法：
　　將24只SPF級BABL/c雌性小鼠隨機分為四組:正常對照組(CK)、哮喘組(AS)、D1類受體拮抗劑SCH23390干預哮喘組(SCH干預組)和D1類受體激動劑SKF83959干預哮喘組（SKF干預組）各6只。用OVA致敏、激發(fā)建立急性哮喘模型，正常對照組以等體積的PBS代替OVA致敏、激發(fā)，SCH干預組和SKF干預組每次霧化前30min均予腹腔注射相應的試劑，末次激發(fā)24 h后處理所有小鼠:(1)對小鼠的

14、一般行為活動進行觀察;(2)收集BALF行細胞計數(shù)、分類，檢測BALF中IL-17的濃度;(3)肺組織病理切片觀察炎癥細胞浸潤及黏液分泌;(4)研磨各組小鼠脾臟，制備單個核細胞懸液，MACS技術分離脾臟CD4+T細胞，計算脾源性CD4+T細胞總數(shù)，判斷細胞活力;(5)測定脾源性CD4+T細胞中Th17細胞的比例及其培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度;(6)乙酰甲膽堿激發(fā)小鼠后，有創(chuàng)肺阻抗法測定小鼠的氣道反應性。
　　結(jié)果：
　　(

15、1)正常組小鼠表現(xiàn)正常，哮喘組小鼠出現(xiàn)典型的哮喘樣癥狀， SCH干預組小鼠癥狀明顯減輕;而SKF干預組小鼠癥狀有所加重;
　　(2)與正常組相比，哮喘組BALF中白細胞總數(shù)、Lym、Neu、Eos數(shù)量及IL-17的濃度均顯著增加（均P＜0.05）;SCH干預組白細胞總數(shù)、Eos、Lym、 Neu數(shù)量及IL-17的濃度均較哮喘組有所降低(P＜0.05);而SKF干預組白細胞總數(shù)、Eos、Lym、Neu數(shù)量及IL-17的濃度均較哮喘組

16、有所增加（P＜0.05）;
　　(3)與正常組相比，哮喘組小鼠肺部大量炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生、氣道分泌大量黏液(P＜0.05);SCH干預組氣道炎癥和黏液高分泌狀態(tài)較哮喘組有所緩解(P＜0.05);而SKF干預組氣道炎癥和黏液高分泌狀態(tài)較哮喘組加重(P＜0.05);
　　(4)與正常組相比，哮喘組小鼠脾臟中CD4+T細胞數(shù)量明顯增多(P＜0.01);與哮喘組相比，SCH干預組脾臟CD4+T細胞數(shù)量均明顯減少(P＜0.01

17、）;與哮喘組相比，SKF干預組脾臟CD4+T細胞數(shù)量均明顯增加(P＜0.01);
　　(5)與正常組相比，哮喘組小鼠脾源性CD4+T細胞中Th17細胞比例及其培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度顯著增加(P＜0.01);SCH干預組Th17細胞比例及其培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度較哮喘組有所降低（P＜0.01）;而SKF干預組Th17細胞比例及其培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度較哮喘組有所降低(P＜0.01);
　　(6)與正常組相比，

18、哮喘組氣道反應性顯著增高(P＜0.05);與哮喘組相比，SCH干預組小鼠氣道反應性有所降低（P＜0.05），而SKF干預組氣道反應性有所升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　(1)本實驗中建立的急性哮喘小鼠模型是成功的，Th17/IL-17軸參與了哮喘的發(fā)病;
　　(2)D1類受體參與了哮喘的發(fā)病，對Th17/IL-17軸的調(diào)節(jié)是其中的一個機制。
　　第二章多巴胺D1類受體調(diào)控BATF促進Th17細胞的分化

19、r>　　目的：
　　(1)探討在體外D1類受體對Th17細胞分化的影響及D1類受體對BATF表達的影響;
　　(2)證實D1類受體通過調(diào)控BATF促進Th17細胞的分化。
　　方法：
　　體外實驗分兩部分:第一部分將MACS分離純化獲得的正常小鼠脾CD4+T細胞分成三組:原液對照組、D1類受體拮抗劑SCH23390干預組和D1類受體激動劑SKF83959干預組。每組予Th17細胞定向分化的環(huán)境，并予相應的試劑干預

20、。培養(yǎng)分化細胞后，分別用流式細胞術檢測Th17細胞的比例，ELISA檢測培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度，WB檢測RORγt和BATF的表達。
　　第二部分將正常小鼠脾CD4+T細胞分成兩組:BATF-siRNA組和對照siRNA組。首先我們分別用可以沉默BATF表達的BATF siRNA和對照siRNA(即無干擾效果的siRNA)轉(zhuǎn)染兩組小鼠脾CD4+T細胞，再予Th17細胞定向分化的環(huán)境，同時加入D1類受體激動劑SKF83959。

21、培養(yǎng)分化細胞后，用WB檢測BATF的表達，評估用siRNA轉(zhuǎn)染細胞后，BATF的沉默效果。在檢測到BATF的沉默效果佳后，用流式細胞術檢測Th17細胞的比例，WB檢測RORγt的表達，ELISA檢測培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度，觀察D1類受體激活后，BATF基因部分沉默和正常表達時Th17細胞的分化情況。
　　結(jié)果：
　　(1)與原液對照組相比，SCH23390干預組Th17細胞所占的比例明顯下降（P＜0.01），而SKF8

22、3959干預組Th17細胞所占的比例有所升高（P＜0.01）;
　　(2)與原液對照組相比，SCH23390干預組培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度明顯下降(P＜0.01)，而SKF83959干預組培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度明顯升高(P＜0.01);
　　(3)與原液對照組相比，SCH23390干預組RORγt的表達明顯下降(P＜0.01)，而SKF83959干預組RORγt的表達明顯升高(P＜0.0t);
　　(4)與原

23、液對照組相比，SCH23390干預組BATF的表達明顯下降(P＜0.01)，而SKF83959干預組BATF的表達明顯升高(P＜0.01);
　　(5)BATF-siRNA組BATF的表達比對照siRNA組明顯下降(P＜0.01);
　　(6)BATF-siRNA組Th17細胞所占的比例比對照siRNA組明顯下降(P＜0.01);
　　(7)BATF-siRNA組RORγt的表達比對照siRNA組明顯下降（P＜0.01