清開靈注射液通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑抗人食管癌Ec-109細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　探討清開靈注射液對(duì)人食管癌 Ec-109細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在誘導(dǎo)Ec-109細(xì)胞凋亡中的作用和相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、四氮噻唑藍(lán)法（MTT法）檢測(cè)清開靈注射液對(duì)人食管癌Ec-109細(xì)胞增殖活性的影響：用不同劑量的清開靈注射液（清開靈注射液的劑量用完全培養(yǎng)基稀釋倍數(shù)來表示，清開靈低劑量為1/100；清開靈中劑量為1/75；清開靈高劑量為1/50）分別作用于Ec-109細(xì)胞不同的時(shí)間長(zhǎng)度（

2、包括12h、24h、36h、48h），并且設(shè)立陰性對(duì)照組（用等體積的完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞）和陽(yáng)性對(duì)照組（5氟尿嘧啶，用藥濃度為500μg/ml），通過觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率等，比較分析清開靈注射液對(duì)人食管癌Ec-109細(xì)胞生存率的時(shí)效和量效關(guān)系。
　　2、免疫熒光染色法檢測(cè)清開靈注射液作用于人食管癌Ec-109細(xì)胞后細(xì)胞凋亡狀況：細(xì)胞貼壁后加入正常培養(yǎng)基（陰性對(duì)照組）和同體積含1/100、1/75的清開靈注射液的

3、培養(yǎng)基（清開靈用藥組）處理細(xì)胞24h和48h，AO/EB染色后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡狀況。
　　3、流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞生長(zhǎng)周期：細(xì)胞貼壁后加入正常培養(yǎng)基（陰性對(duì)照組）和同體積含1/100、1/75的清開靈注射液的培養(yǎng)基（清開靈用藥組）處理細(xì)胞24h和48h，用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率。
　　4、免疫印跡法（Western Blot）對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的測(cè)定：細(xì)胞傳代至培養(yǎng)瓶貼壁后，

4、分別用正常培養(yǎng)基和同體積含1/100、1/75的清開靈注射液的培養(yǎng)基處理細(xì)胞24h和48h，提取細(xì)胞總蛋白，免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)周期蛋白（CyclinB1、CDK1）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路的相關(guān)蛋白（Caspase-4、CHOP）表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、 MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：清開靈注射液處理人食管癌Ec-109細(xì)胞后，與陰性對(duì)照組相比，結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05），其中能表明清開靈注射液對(duì)食管癌Ec-

5、109細(xì)胞量效關(guān)系的直線回歸方程為：Y=31.567X+0.1522，R2=0.999，P=0.000﹤0.05。
　　2、免疫熒光染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：清開靈注射液處理人食管癌Ec-109細(xì)胞后，在倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，清開靈注射液用藥組細(xì)胞與陰性對(duì)照組相比，有較多的凋亡，表現(xiàn)為部分細(xì)胞核染色質(zhì)被染成橘紅色，同時(shí)可見部分細(xì)胞縮小或呈半月形等。
　　3、流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期和凋亡率檢測(cè)表明：用清開靈注射液處理人食管癌Ec-

6、109細(xì)胞后，與陰性對(duì)照組相比，分布在 G2/M期的細(xì)胞數(shù)明顯增加，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）；與陰性對(duì)照組相比，清開靈注射液組細(xì)胞的凋亡率明顯增加，其數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。
　　4、 Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相關(guān)細(xì)胞周期蛋白CyclinB1和CDK1的表達(dá)量，與陰性對(duì)照組相比，清開靈注射液用藥組明顯減少，并且用藥劑量越大、作用時(shí)間越長(zhǎng)，表達(dá)量越少；而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的蛋白C

7、aspase-4、CHOP的表達(dá)呈增多趨勢(shì)，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、清開靈注射液能明顯的抑制人食管癌Ec-109細(xì)胞的生長(zhǎng)，主要表現(xiàn)在誘導(dǎo)凋亡和抑制增殖兩方面，且具有劑量和時(shí)間相關(guān)性。
　　2、清開靈注射液抑制人食管癌 Ec-109細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與相關(guān)周期調(diào)控因子CyclinB1和CDK1高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G2/M期有關(guān)。
　　3、在清開靈注射液