甲氨蝶呤通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑預防膝關節(jié)術后瘢痕粘連的實驗研究.pdf

1、目的:探討局部應用不同濃度的甲氨蝶呤(MTX)誘導成纖維細胞凋亡及其預防膝關節(jié)術后瘢痕粘連的作用，并研究其可能機制。
　　方法:將18只成年新西蘭大兔平均三組，分別是2 mg/ml組、1 mg/ml組和生理鹽水對照組。耳緣靜脈注射質(zhì)量百分比為2％的戊巴比妥鈉麻醉后，備皮、消毒術區(qū)，打開膝關節(jié)后，用電鉆在股骨內(nèi)外側(cè)髁制成約10mm×10mm的骨缺損區(qū)，將對應的不同濃度的MTX和生理鹽水應用于骨缺損區(qū)，術后常規(guī)消毒和抗生素治療3天，并

2、用克氏針固定在完全屈曲的位置4周。4周后將兔子處理后，瘢痕組織制成標本，行HE染色和Masson染色觀察MTX預防膝關節(jié)疤痕粘連的效果以及免疫組織化學法檢測膝關節(jié)瘢痕中CHOP的表達量的變化。體外培養(yǎng)成纖維細胞，以不同濃度的MTX處理24h后，CCK-8檢測成纖維細胞的活力變化，Hoechst33342染色法觀察應用MTX處理對成纖維細胞凋亡的影響。Westem-blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和凋亡相關蛋白表達情況，如cleaved PARP、

3、CHOP、Bcl-2、Bax。
　　結(jié)果:本實驗中所有的動物未發(fā)生死亡、皮膚壞死、膝關節(jié)感染等現(xiàn)象，恢復情況良好。HE染色結(jié)果:2 mg/ml MTX組和1 mg/ml MTX組瘢痕中成纖維細胞數(shù)量小于對照組瘢痕組織中的數(shù)量(P＜0.05)，而2 mg/ml MTX組瘢痕中成纖維細胞數(shù)量也小于1 mg/ml MTX組瘢痕中數(shù)量，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Masson染色觀察的結(jié)果:對照組兔膝關節(jié)內(nèi)可見致密的瘢痕組織、大量

4、的膠原和成纖維細胞沉積，而實驗組中瘢痕組織明顯減少，膠原含量明顯降低，且2 mg/ml MTX組較1 mg/mlMTX組瘢痕組織及膠原含量更低，ImagePro Plus分析后可知膠原密度隨著濃度的增加而逐漸降低，各組間的差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。免疫組織化學結(jié)果以Image Pro Plus分析后顯示2 mg/ml MTX組瘢痕組織中CHOP的表達量明顯高于1 mg/ml MTX組和對照組中CHOP的表達量(P＜0.05);

5、而1 mg/mlMTX組瘢痕中CHOP的表達量明顯高于對照組的中CHOP的表達量(P＜0.05)，表明CHOP表達隨著濃度的增高而升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激路徑可能參與了MTX的作用過程。體外細胞實驗顯示MTX能有效抑制成纖維細胞的增殖和活力，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴的趨勢，Hoechst染色發(fā)現(xiàn)MTX處理組的凋亡細胞明顯多于對照組。Westem-blot結(jié)果顯示MTX處理后的成纖維細胞隨著時間延長，cleaved-PARP的表達量增高，同時CHOP