BAG-1沉默對OGD-R誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡及HSP70表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　探討慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)（RNA interference,RNAi）下調(diào)BCL-2結(jié)合抗凋亡基因（BCL-2 associated anthanogen-1,BAG-1）表達(dá)對氧糖剝奪/再復(fù)氧誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）凋亡及熱休克蛋白70（Heat Shock Protein70,HSP70）表達(dá)的影響。
　　方法：
　　構(gòu)建靶向BAG-1 RNAi慢病毒載體，感染對數(shù)生長期的SH-S

2、Y5Y細(xì)胞，抑制BAG-1表達(dá)。采用熒光顯微鏡觀察熒光，嘌呤霉素篩選細(xì)胞，保證感染效率>75%。轉(zhuǎn)染成功后細(xì)胞分組如下：正常細(xì)胞組（未感染慢病毒的正常SH-SY5Y細(xì)胞）；慢病毒對照組[感染含增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）基因的慢病毒]；BAG-1 RNAi組（即BAG-1基因沉默組，感染含BAG-1基因干擾序列及EGFP的慢病毒），根據(jù)所用序列不同分為BAG-1 RNAi-α組、BAG-1 RNAi-β組。慢病毒感染后72 h采用蛋白質(zhì)

3、免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blot）檢測BAG-1 RNAi組細(xì)胞BAG-1蛋白表達(dá)情況，確定干擾效果。4組細(xì)胞分別給予氧糖剝奪4 h，8 h，12 h，24 h并復(fù)氧24 h處理，采用細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（CCK-8）檢測不同氧糖剝奪條件下各組細(xì)胞活性，確定最佳氧糖剝奪時間模擬神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷，并比較各組間細(xì)胞活性的差異。采用流式細(xì)胞儀檢測氧糖剝奪8 h再復(fù)氧24 h各組細(xì)胞凋亡情況；Western Blot及實(shí)時熒

4、光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測HSP70蛋白表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄水平。多組樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)用于兩兩比較。結(jié)果
　　1.慢病毒感染及BAG-1基因沉默效果：感染后72 h熒光顯微鏡明暗場對比顯示慢病毒對照組、BAG-1 RNAi-α組、BAG-1 RNAi-β組3組細(xì)胞慢病毒感染效率均在75%以上；Western Blot結(jié)果顯示，BAG-1RNAi-β組BAG-1干擾效果優(yōu)于BAG

5、-1 RNAi-α組。
　　2.BAG-1基因沉默降低氧糖剝奪/再復(fù)氧損傷SH-SY5Y細(xì)胞活性：CCK-8結(jié)果顯示，各組細(xì)胞活性隨缺氧時間延長，先增強(qiáng)后減弱，且于8h達(dá)峰值，因此采用氧糖剝奪8 h，再復(fù)氧24 h的SH-SY5Y細(xì)胞作為神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷細(xì)胞模型。經(jīng)缺氧8 h再復(fù)氧24 h處理后，BAG-1 RNAi-β組吸光度（A值）顯著低于正常細(xì)胞組、慢病毒對照組及BAG-1 RNAi-α組（A值：0.591±0.091

6、比0.937±0.118，0.902±0.106，0.910±0.139，均P＜0.01）。
　　3.BAG-1基因沉默導(dǎo)致氧糖剝奪/再復(fù)氧損傷 SH-SY5Y細(xì)胞凋亡增加：BAG-1 RNAi-β組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常細(xì)胞組、慢病毒對照組及BAG-1 RNAi-α組[凋亡率（%）：34.633±3.464比14.833±3.753，19.933±6.490，16.400±1.179，均P＜0.01]。
　　4.BAG-1

7、基因沉默對HSP70蛋白表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響：正常細(xì)胞組、慢病毒對照組、BAG-1 RNAi-α組與 BAG-1 RNAi-β組細(xì)胞的 HSP70蛋白表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。4組細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)（灰度值）依次為：1.440±0.105，1.325±0.169，1.355±0.232，1.430±0.117。mRNA轉(zhuǎn)錄水平（2-△△Ct）：0.996±0.060，0.956±0.155，

8、1.047±0.154，1.002±0.178。
　　結(jié)論：
　　1.不同氧糖剝奪時間對細(xì)胞活性影響不同，氧糖剝奪8 h，再復(fù)氧24 h的SH-SY5Y細(xì)胞可作為神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷模型。
　　2.BAG-1可能對氧糖剝奪/再復(fù)氧損傷SH-SY5Y細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。
　　3.BAG-1基因有效沉默后，HSP70表達(dá)水平?jīng)]有變化，為進(jìn)一步探討B(tài)AG-1/HSP70相互作用在缺血性腦血管疾病的研究提供一定的實(shí)