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1、目的:細(xì)胞周期調(diào)節(jié)紊亂在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)及其與上、下游基因形成的信號(hào)通路可影響能量代謝、自噬、細(xì)胞周期調(diào)控等過程,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。近年來,食管腺癌(EAC)的發(fā)病率劇增,因其總體預(yù)后較差,具有廣泛浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等重要特征,故目前主要采取包括放療在內(nèi)的多學(xué)科綜合治療。然而,這種治療模式存在諸多副作用,尋求高效低毒
2、藥物、提高放療效果,成為近年來食管癌治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。作為一種具有多重藥理學(xué)活性的多酚類化合物,白藜蘆醇(RSV)的抗腫瘤作用及分子機(jī)制已引起廣泛關(guān)注。本研究應(yīng)用RSV作用于兩種食管腺癌細(xì)胞系(OE33和OE19),觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移能力及放射敏感性的影響,并探討其作用機(jī)制。
方法:①M(fèi)TT比色法及BrdU摻入法評(píng)價(jià)RSV對(duì)EAC細(xì)胞增殖、DNA合成的影響;②貼壁實(shí)驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)及穿孔試驗(yàn)評(píng)價(jià)RSV對(duì)EAC細(xì)胞浸潤(rùn)、遷移能
3、力的影響;③Western blot法測(cè)定AMPK蛋白、磷酸化AMPK蛋白(P-AMPK)、p27Kipl蛋白、P-p27Kipl蛋白、S期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)水平,特異性熒光多肽底物(Suc-LLVY-AMC)評(píng)價(jià)26S蛋白酶體活性;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)RSV對(duì)EAC細(xì)胞p27Kipl mRNA表達(dá)水平的影響;流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布變化,以探討RSV影響EAC細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)及遷移能力的機(jī)制;④通過細(xì)胞克隆
4、形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EAC細(xì)胞存活率,按多靶單擊模型擬合細(xì)胞存活曲線,計(jì)算反映放射敏感性的指標(biāo),包括2Gy時(shí)的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF2)、平均致死劑量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq)和放射增敏比(SER),以評(píng)價(jià)RSV對(duì)EAC細(xì)胞的放射增敏作用;⑤通過流式細(xì)胞儀分析單獨(dú)X線照射(IR)和IR聯(lián)合RSV對(duì)EAC細(xì)胞周期分布的影響,Western blot法半定量分析KU80蛋白、KU70蛋白、RAD51蛋白的變化,闡明RSV放療增敏的機(jī)制。
結(jié)果
5、:⑴MTT比色法和BrdU摻入法顯示:RSV抑制體外培養(yǎng)的OE33、OE19細(xì)胞生長(zhǎng)及DNA合成,隨藥物濃度的增高及作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞的抑制率逐漸升高,兩種細(xì)胞在24 h的IC50分別為94.83μ M、97.07μ M;⑵不同濃度RSV作用后,OE33、OE19細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,體積明顯縮小,并可見核染色質(zhì)凝聚,核固縮等表現(xiàn);⑶RSV作用于OE33、OE19細(xì)胞,細(xì)胞的貼壁能力隨藥物濃度的增高而逐漸減弱;⑷細(xì)胞劃痕試驗(yàn)及穿孔試驗(yàn)結(jié)果顯
6、示,OE33、OE19細(xì)胞在RSV作用下,其侵襲、遷移能力隨藥物濃度的增高而逐漸減弱;0、50、100μM RSV作用后,穿膜的OE33細(xì)胞數(shù)均值分別為196.13、67.25和25.38,穿膜的OE19細(xì)胞數(shù)均值分別為205.61、73.36和29.63,差異有顯著性;⑸流式細(xì)胞術(shù)分析表明:RSV可使G1期細(xì)胞比例增加,S期細(xì)胞比例減少;單獨(dú)X線照射(TR) OE33、OE19細(xì)胞使存活分?jǐn)?shù)呈劑量依賴性下降,并出現(xiàn)G2/M期阻滯,S期
7、細(xì)胞明顯減少;50μM RSV處理24h可逆轉(zhuǎn)IR引起的G2/M期阻滯;⑹應(yīng)用western blot法和BrdU摻入法分析顯示:EAC細(xì)胞中磷酸化AMPK蛋白(P-AMPK)水平隨RSV的濃度增加而增加,總AMPK的水平及蛋白表達(dá)未見增加;AMPK蛋白抑制劑(復(fù)合物C)或轉(zhuǎn)染AMPKα siRNA,可逆轉(zhuǎn)RSV對(duì)DNA合成的抑制作用;⑺應(yīng)用western blot法及RT-PCR分析顯示:RSV能顯著增加OE33細(xì)胞p27Kipl蛋白
8、水平,但未改變p27Kipl mRNA水平;以復(fù)合物C預(yù)處理或轉(zhuǎn)染AMPKαsiRNA,均可逆轉(zhuǎn)RSV誘導(dǎo)的p27Kipl蛋白增加和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制,而未改變p27KiplmRNA水平,這表明RSV對(duì)p27Kipl蛋白的調(diào)控過程是AMPK依賴性的,而不是p27Kipl基因依賴性的;⑻AMPK激活劑(AICAR)和AMPK抑制劑(復(fù)合物C)均未改變P-p27Kipl占總p27Kipl蛋白(T-p27Kipl)的比率,并且蛋白酶體抑制劑MG13
9、2可完全阻斷復(fù)合物C對(duì)p27Kipl蛋白穩(wěn)定性的影響,這表明AMPK對(duì)p27Kipl的調(diào)控作用并非通過蛋白磷酸化而實(shí)現(xiàn),抑制AMPK的活性時(shí),26S蛋白酶體的活性上調(diào)而加速p27Kipl蛋白的降解;⑼特異性熒光多肽底物檢測(cè)法顯示:RSV顯著降低EAC細(xì)胞中26S蛋白酶體活性,以復(fù)合物C預(yù)處理或轉(zhuǎn)染AMPKα siRNA,均可逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。由此可見,RSV是通過調(diào)控26S蛋白酶體通路(而不是基因轉(zhuǎn)錄變化)使p27Kipl蛋白水平升高;⑽S
10、kp2作為一種泛素-E3連接酶,對(duì)各種細(xì)胞26S蛋白酶體依賴性p27Kipl蛋白的泛素化降解起主要限速調(diào)節(jié)因子的作用。RSV可使OE33細(xì)胞Skp2蛋白水平下調(diào),而復(fù)合物C預(yù)處理或AMPKα siRNA轉(zhuǎn)染可“抵消”RSV引起的Skp2蛋白水平降低,這表明RSV通過活化AMPK下調(diào)Skp2蛋白水平;⑾BrdU摻入法顯示,以p27Kipl siRNA轉(zhuǎn)染EAC細(xì)胞,可“抵消”AICAR或RSV對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng),證實(shí)RSV或AICAR可
11、“活化”AMPK蛋白、下調(diào)p27Kipl蛋白水平,抑制細(xì)胞增殖;⑿細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果:相同照射劑量下,EAC細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)隨RSV濃度的升高而降低,相同濃度RSV,細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)隨照射劑量的升高而降低;隨沙利度胺濃度的增加,EAC細(xì)胞的D0、Dq、SF2值均逐漸減小,SEED0逐漸增大,說明RSV對(duì)EAC細(xì)胞具有放射增敏作用,呈濃度依賴性;⒀應(yīng)用Wwestern blot法分析顯示:RSV可以使EAC細(xì)胞中RAD51蛋白(主要參與同源重組
12、修復(fù))表達(dá)下調(diào),RSV聯(lián)合X線照射組RAD51顯著下調(diào),KU80、KU70無顯著變化,而單獨(dú)X線照射細(xì)胞RAD51、KU80及KU70均無顯著變化。因此,抑制RAD51蛋白表達(dá)可能是RSV增強(qiáng)EAC細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制之一。
結(jié)論:①白藜蘆醇抑制體外培養(yǎng)的食管腺癌細(xì)胞增殖、遷移及轉(zhuǎn)移,是由于AMPK蛋白磷酸化導(dǎo)致26S蛋白酶體依賴性的p27Kipl蛋白增加,進(jìn)而引起細(xì)胞周期重分布,即G0/G1期細(xì)胞比例增加,S期細(xì)胞比例減少。
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