脂聯(lián)素基因去信號肽區(qū)原核表達及酶免檢測方法研究.pdf

1、近年來,肥胖癥、Ⅱ型糖尿病、動脈粥樣硬化發(fā)病率不斷升高,血漿中脂聯(lián)素(adiponectin,ADPN)的含量與這類疾病的發(fā)生呈負相關(guān),通過檢測人血漿中脂聯(lián)素的含量可反應(yīng)這類疾病的發(fā)生狀況。本研究通過基因工程獲得了人脂聯(lián)素去信號肽區(qū)域重組蛋白,并以此制備標(biāo)準品,初步建立了人脂聯(lián)素ELISA定量檢測方法。
　　 根據(jù)NCBI上公布的人脂聯(lián)素基因序列NM_004797.2,利用primer5.0設(shè)計一對引物。從人脂肪組織中提取總RN

2、A,通過RT-PCR獲得678bp的人脂聯(lián)素去信號肽區(qū)的基因片段,將目的片段和載體pET-41a分別進行雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳,回收純化目的片段和載體并進行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α,涂布LB固體培養(yǎng)基,挑取單菌落,擴大培養(yǎng)后用堿裂解法提取質(zhì)粒,將雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pET-41a/△SADPN。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE)3中,用IPTG進行誘導(dǎo)表達,SDS-PAGE表明重組蛋白以可溶性形式表達,并具有

3、較好的免疫反應(yīng)性。
　　 通過誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化,確立了最佳的誘導(dǎo)條件為:25℃,IPTG濃度0.03mmol/L,誘導(dǎo)時間8h。融合蛋白含有組氨酸標(biāo)簽,用鎳離子親和層析純化目的蛋白,得到的融合蛋白溶液,經(jīng)檢測其濃度為2.1mg/mL,純化后的蛋白制備成標(biāo)準品。
　　 以抗人脂聯(lián)素單克隆抗體作為包被抗體,采用改良的過碘酸鈉法,對人脂聯(lián)素多克隆抗體進行辣根過氧化物酶標(biāo)記,作為標(biāo)記抗體。棋盤滴定法確立人脂聯(lián)素單克隆抗體的最佳