SM22α參與TNF-α誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞炎癥應(yīng)答的機(jī)制.pdf

1、目的:內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)炎癥應(yīng)答是血管損傷修復(fù)和內(nèi)膜增生的主要病理基礎(chǔ)。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)在炎癥應(yīng)答,免疫應(yīng)答,細(xì)胞增殖和凋亡過程中具有重要作用。TNF-α通過激活細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)的信號(hào)通路尤其是NF-κB通路而誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)各種炎癥標(biāo)志物;在血管損傷局部浸潤的炎性細(xì)胞,通過分泌TNF-α而誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化

2、和增殖。
　　 SM22α是分化型VSMC特異表達(dá)的一種小分子蛋白,該蛋白的表達(dá)活性與VSMC表型狀態(tài)密切相關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn),在缺失SM22α的小鼠,頸動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫誘導(dǎo)的血管損傷,表現(xiàn)為增強(qiáng)的氧化應(yīng)激,伴有NF-κB激活及核轉(zhuǎn)位和促炎基因表達(dá)活性的升高。本研究利用體外培養(yǎng)的VSMC,通過敲低和過表達(dá)技術(shù),探討SM22α在TNF-α誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答中的作用。
　　 方法:按貼塊法分離培養(yǎng) VSMC,取3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn);采

3、用Western blot和免疫細(xì)胞熒光染色進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞定位分析;采用DHE(超氧化物陰離子熒光探針)熒光染色法觀察細(xì)胞活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、TNF-α誘導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)位
　　 用不同濃度(0,5,10,20 ng/ml)TNF-α刺激培養(yǎng)的VSMC不同時(shí)間(0,10,20,30,60 min)后,觀察對(duì)NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響

4、。Westernblot結(jié)果顯示,TNF-α可劑量依賴性激活NF-κB核轉(zhuǎn)位,而且,10 ng/mlTNF-α處理細(xì)胞30 min時(shí),NF-κB p65核轉(zhuǎn)位活性達(dá)到峰值(p＜0.05),但總NF-κB p65水平?jīng)]有明顯變化。提示TNF-α可誘導(dǎo)VSMCs炎癥應(yīng)答。
　　 2、敲低SM22α增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位
　　 采用SM22α特異性小干擾RNA(siSM22α)轉(zhuǎn)染VSMC,敲低內(nèi)源性SM22α表

5、達(dá)。Western bolt分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染siSM22α后,其SM22α的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。免疫熒光染色結(jié)果顯示,給予TNF-α刺激或敲低SM22α后,NF-κB p65核轉(zhuǎn)位活性明顯升高;而且,敲低SM22α后再給予TNF-α刺激,NF-κB p65核轉(zhuǎn)位活性升高更明顯。提示敲低SM22α可促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位。
　　 3、敲低SM22α促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的IKK磷酸化
　　 We

6、stern blot顯示,處于靜止期的VSMCs,其細(xì)胞內(nèi)IKK磷酸化水平很低。給予TNF-α刺激或者敲低SM22α后,均誘導(dǎo)IKK的磷酸化水平升高(P＜0.05)。而且,敲低SM22α后給予TNF-α刺激,與對(duì)照組和單獨(dú)給予刺激組相比,IKK的磷酸化水平明顯升高(P＜0.01)。
　　 4、敲低SM22α增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的VSMCs氧化應(yīng)激
　　 采用DHE熒光染色法觀察敲低SM22α對(duì)ROS的影響。結(jié)果顯示,與對(duì)照

7、組相比,TNF-α刺激后,ROS生成有所增加。值得注意的是,在單獨(dú)敲除SM22α后,與對(duì)照組相比,VSMCs中ROS的生成也有一定程度的升高。在敲低SM22α后再給予TNF-α刺激,ROS的生成與對(duì)照組相比明顯增強(qiáng),與單獨(dú)給予TNF-α刺激或單獨(dú)敲低SM22α組相比亦有一定程度的增高。
　　 5、敲低SM22α增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的Akt途徑的激活
　　 Western blot分析顯示,與對(duì)照組相比,給予TNF-α刺激后

8、,能夠明顯上調(diào)Akt的磷酸化水平;同樣,在僅敲低SM22α的VSMC中,P-Akt的水平也明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。敲低SM22α后再給予TNF-α刺激時(shí),AKT磷酸化水平升高幅度明顯大于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 6、過表達(dá)SM22α抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位
　　 給予ATRA處理細(xì)胞,以上調(diào)SM22α表達(dá);隨后,再給予TNF-α刺激。Western blot分析結(jié)果顯示,與單獨(dú)TNF-α

9、刺激相比,SM22α過表達(dá)能夠抵消TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位。此外,利用pAd-SM22α腺病毒感染細(xì)胞,使外源性的SM22α過表達(dá),然后給予TNF-α刺激,免疫熒光染色分析結(jié)果顯示,過表達(dá)外源性SM22α后同樣能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位。結(jié)果表明,SM22α可在一定程度上抑制炎癥刺激誘導(dǎo)的VSMC炎癥應(yīng)答。
　　 結(jié)論:
　　 1、TNF-α誘導(dǎo)VSMC NF-κB核轉(zhuǎn)位活化;