同型半胱氨酸對內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-2及與樹突狀細(xì)胞黏附的影響.pdf

1、同型半胱氨酸對內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-2及與樹突狀細(xì)胞黏附的影響[目的]近年來認(rèn)為，動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病，炎癥和免疫是致AS發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。細(xì)胞間黏附分子-2(ICAM-2)大量表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞表面，特異性介導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)與血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)地黏附及移行，在致AS的早期免疫應(yīng)答中起重要作用。同型半胱氨酸(Hcy)是AS的一個獨立危險因子，但其致AS的機制尚未完全闡明。本研究通過觀察Hcy對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)

2、胞(HUVECs)分泌和表達(dá)ICAM-2，以及對DC與EC黏附的影響，探討Hcy在AS發(fā)生中的作用機制。 [方法]1、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)培養(yǎng)：取健康產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)臍帶，用0.1％Ⅰ型膠原酶消化獲得HUVECs，接種于M199培養(yǎng)基(含15％胎牛血清，10ng/mlEGF)，后每2到3天換一次液，直至細(xì)胞80％融合，用無血清培養(yǎng)基孵育24h后用于實驗。用Ⅷ因子抗體鑒定呈陽性，陽性細(xì)胞的胞漿內(nèi)有棕色顆粒。 2、人外

3、周血樹突狀細(xì)胞(DC)培養(yǎng)：取新鮮分離的健康成人外周血白細(xì)胞懸液，用淋巴細(xì)胞分離液收集單個核細(xì)胞，再用CD14+磁珠分選出純度大于98％的CD14+單核細(xì)胞，種于含rhGM-CSF(20ng/mL)、rhIL-4(2ng/mL)、15％胎牛血清的完全培養(yǎng)基RPMI1640中，隔天半量換液，第5天收集懸浮細(xì)胞作為未成熟DC用于黏附試驗。 3、用0.5mmol/L的Hcy分別作用HUVECs2h，4h，6h，12h，24h，48h，

4、以及分別用0.01mmol/L，0.05mmol/L，0.1mmol/L，0.25mmol/L，0.5mmol/L，1.0mmol/L的Hcy作用24h后；用MTT法檢測細(xì)胞活力，用ELISA法檢測上述培養(yǎng)上清液中HUVECs分泌ICAM-2的蛋白含量，用Westernblot法檢測HUVECs表達(dá)ICAM-2的蛋白含量，用RT-PCR法檢測HUVECs表達(dá)ICAM-2的mRNA含量。 4、分別用0.5mmol/L的Hcy，10

5、0μmol/L的葉酸(FA)，F(xiàn)A+Hcy(FH)，10ng/ml的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，TNF-α+Hcy(TH)作用HUVECs24h后，用MTT法檢測細(xì)胞活力，用Westernblot法檢測HUVECs表達(dá)ICAM-2的蛋白含量，用RT-PCR法檢測HUVECs表達(dá)ICAM-2的mRNA含量。 5、DC-EC的黏附：用不同濃度的Hcy以及FA，F(xiàn)H，TNF-α，TH作用HUVECs24h后，將標(biāo)記有CMFDA分子

6、探針的DC加入HUVECs中，共孵育1h。其中，0.5mmol/L的Hcy作用的HUVECs中部分加入25μg/mL的抗人ICAM-2抗體(HI組)與DC、EC共孵育1h。黏附完成后，在共聚焦顯微鏡下觀察DC與EC的黏附情況。 [結(jié)果]1、用0.5mmol/L的Hcy作用HUVECs不同時間后，HUVECs細(xì)胞活力無顯著差異(P＞0.05)；上清中ICAM-2的蛋白分泌在12h開始高于空白組(P＜0.05)，24h和48h均增加

7、顯著(P＜0.01)；HUVECs中ICAM-2的蛋白表達(dá)在6h開始高于空白組(P＜0.05)，24h達(dá)峰值(P＜0.01)，48h下降顯著，且與空白組相比無顯著性差異；ICAM-2的mRNA表達(dá)在12h開始高于空白組(P＜0.05)，24h和48h均增加顯著(P＜0.01)。用不同濃度的Hcy作用HUVECs24h后，HUVECs細(xì)胞活力無顯著差異(P＞0.05)；ICAM-2的蛋白分泌和表達(dá)均呈劑量依賴性增加，當(dāng)Hcy濃度高于0.5

8、mmol/L時增加更顯著(P＜0.01)；ICAM-2的mRNA表達(dá)在0.05mmol/L時開始高于空白組(P＜0.05)，當(dāng)Hcy濃度高于0.25mmol/L時增加更顯著(P＜0.01)。 2、分別用0.5mmol/L的Hcy，100μmol/L的FA，F(xiàn)H，10ng/ml的TNF-α,TH作用HUVECs24h后，HUVECs細(xì)胞活力無顯著差異(P＞0.05)；FA，F(xiàn)H，TNF-α作用后，ICAM-2的蛋白表達(dá)和mRNA表

9、達(dá)與對照組相比均無顯著性差異；Hcy，TH作用后，ICAM-2的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)與對照組相比均顯著增加(P＜0.01)，但Hcy組與TH組相比ICAM-2的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)均無顯著性差異。 3、DC-EC的黏附結(jié)果：用不同濃度的Hcy作用HUVECs24h后，0.1mmol/L和0.25mmol/L組DC黏附的數(shù)量明顯增多，0.5mmol/L組DC黏附的數(shù)量與對照組相比顯著增多(P＜0.05)，而1.0mmol/L組

10、則增加更顯著(P＜0.01)。FA組，F(xiàn)H組以及HI組DC黏附數(shù)量與對照組相比無顯著性差異；而Hcy組，TNF-α組與對照組相比DC黏附數(shù)量顯著增多(P＜0.05)，而TH組與對照組相比增多更顯著(P＜0.01)；TH組與Hcy組及TNF-α組相比DC黏附數(shù)量均顯著增多(P＜0.01)。 [結(jié)論]1、Hcy呈時間依賴性和濃度依賴性地刺激HUVECs表達(dá)和分泌ICAM-2，從而促進(jìn)DC與EC的黏附，這可能為其誘導(dǎo)AS早期形成的重要

11、機制之一。 2、用抗人ICAM-2抗體封閉Hcy誘導(dǎo)的HUVECsICAM-2表達(dá)后，DC與EC的黏附顯著抑制，提示ICAM-2在介導(dǎo)DC與EC的黏附中起了重要作用。 3、葉酸與Hcy共同作用后，能有效減少ICAM-2表達(dá)，抑制DC與EC黏附，進(jìn)一步證實Hcy能夠特異性誘導(dǎo)ICAM-2表達(dá)及DC-EC黏附。而TNF-α對ICAM-2的表達(dá)無影響，但能促進(jìn)DC與EC的黏附，提示ICAM-2在介導(dǎo)DC與EC的黏附過程中并不是