重組人Kringle 5和溶血磷脂酸（LPA）在眼表炎癥性疾病中的作用.pdf

1、眼表疾病是一組臨床常見病，其中角膜新生血管(Comeal neovascularization,CNV)是各種致病因素所引起的嚴重眼表并發(fā)癥，是最常見、治療最棘手的致盲性眼病之一。不但嚴重影響視力，而且也是同種異體角膜移植術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)的高危因素。至今，CNV的發(fā)病機理尚未明確，治療上也沒有理想的方法。因此，人們一直在研究角膜新生血管生成的發(fā)病機制和能阻止角膜新生血管生成的抑制劑。近年來，隨著對腫瘤和眼部新生血管的深入研究，在角膜新生

2、血管抑制劑方面的研究已取得了迅猛發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了許多角膜新生血管形成抑制劑。Kringle5(K5蛋白)是一種新型有效的血管生成抑制因子，是血漿纖溶酶原的一種蛋白水解片段，由約80個氨基酸殘基組成。體外細胞培養(yǎng)顯示，K5蛋白可以明顯抑制人血管內(nèi)皮細胞的增殖和移行，誘導(dǎo)增殖中的內(nèi)皮細胞凋亡或引起細胞周期停滯，其抑制效果是血管生成抑制素的50倍。在正常氧及低氧條件下，重組人K5蛋白對人原代視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞增殖呈現(xiàn)一種劑量依賴性的抑制作用；

3、玻璃體腔內(nèi)注射K5蛋白可預(yù)防或阻滯缺血性視網(wǎng)膜新生血管的進展。但其對CNV的作用及其機制國內(nèi)外尚未見報道。因此，本研究首次將重組人K5蛋白配成不同濃度的滴眼液，用于堿燒傷誘導(dǎo)的兔角膜新生血管模型，采用裂隙燈顯微鏡、組織病理學檢查觀察其對CNV的抑制情況。 近年來，分子水平的研究已取得較大進展，認為血管生成抑制因子與刺激因子所產(chǎn)生的生物網(wǎng)絡(luò)平衡在調(diào)節(jié)血管生成中起重要作用。角膜新生血管的形成不僅要求上調(diào)新生血管刺激因子(如：血管內(nèi)皮

4、細胞生長因子(VEGF))，而且同時下調(diào)新生血管抑制因子(如：血管生成抑制素)。內(nèi)源性的新生血管抑制劑對于維持角膜的無血管狀態(tài)起著尤其重要的作用。在有些病理狀態(tài)下，如角膜移植或化學損傷，角膜的某些部位可提高新生血管刺激因子的產(chǎn)生，并降低新生血管抑制因子的產(chǎn)生，從而打破了新生血管的平衡，導(dǎo)致毛細血管內(nèi)皮細胞過度增殖，最終引起NV。已發(fā)現(xiàn)一些與眼部NV有關(guān)的刺激因子和抑制因子。VEGF是高度選擇性的血管內(nèi)皮細胞有絲分裂原，可調(diào)節(jié)血管滲透性(

5、血管滲透因子)，在炎癥性小鼠CNV中起重要的作用。 NV的形成是一個復(fù)雜的過程，包括內(nèi)皮細胞的增殖，遷移，基底膜的降解，和血管腔的形成。在局部生長因子的控制下，微血管內(nèi)皮細胞的增生是NV形成的關(guān)鍵步驟，為研究K5蛋白抗CNV的分子機制，我們將K5蛋白用于原代培養(yǎng)的新生小牛胸主動脈血管內(nèi)皮細胞(BAEC)，新生小牛胸主動脈血管成纖維細胞(BAFC)，血管平滑肌細胞(VSMC)，檢測K5蛋白對細胞增殖的影響，并采用流式細胞儀檢測K5

6、對細胞周期的影響，同時我們還采用電子顯微鏡檢查，DNA片段分析，和TUNEL方法，在體和離體檢測K5對BAEC凋亡的影響，從結(jié)構(gòu)上深入研究K5的作用機制。 炎癥反應(yīng)貫穿眼表面疾病的整個過程，是常見的病理現(xiàn)象。溶血磷脂酸(LPA)是一重要的脂質(zhì)介質(zhì)，它通過激活G蛋白偶聯(lián)受體產(chǎn)生廣泛的生物學作用，其作用可分為生長相關(guān)的(如：增殖，抗凋亡)和細胞骨架相關(guān)的(如：集合，粘付，收縮，分泌，趨化性)。LPA也參與一些生理病理過程如炎癥反應(yīng)。

7、LPA參與中性粒細胞的運動，極化，及新陳代謝，并且可誘導(dǎo)人類單核細胞的遷移。研究發(fā)現(xiàn)一些脂源性介質(zhì)，如血小板激活因子(PAF)，涉及眼部免疫和炎癥反應(yīng)的啟動，延續(xù)和維持，但是，LPA的生理作用及其受體在眼表炎癥中的作用尚不明確。 在本研究中，我們假設(shè)LPA在人角膜上皮細胞中充當炎癥介質(zhì)的角色。利用已建立的細胞株作為模型系統(tǒng)，檢測LPA的產(chǎn)生，LPA及炎癥因子的信號反應(yīng)，及LPA受體拮抗劑的作用。另外，我們還著重研究K5蛋白與LP

8、A在眼表面炎癥反應(yīng)中的關(guān)系。我們檢測K5蛋白對LPA的產(chǎn)生，LPA誘導(dǎo)的細胞增殖，及LPA誘導(dǎo)的與細胞增殖和炎癥有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。 論文主要包括以下三個部分： 第1章重組人Kringle 5(K5蛋白)滴眼液對堿燒傷 誘導(dǎo)的兔角膜新生血管的治療作用及機制 1.1 重組人K5蛋白滴眼液對角膜新生血管的作用 1.1.1堿燒傷誘導(dǎo)的單眼角膜新生血管(CNV)動物模型的建立

9、 堿燒傷后角膜中央迅速出現(xiàn)一邊界清楚的渾濁區(qū)，PBS沖洗后渾濁加重，變?yōu)榇砂咨?。傷?2小時角膜緣新生血管芽長入角膜，并向中央移行；第2周新生血管生長旺盛，長入燒灼斑：第3周，達角膜中央?yún)^(qū)；第28天血管布滿整個角膜。HE染色可見新生血管自角膜緣長入燒傷區(qū)，伴大量炎性細胞浸潤。 1.1.2 K5蛋白滴眼液對CNV的抑制作用 K5蛋白滴眼液對CNV的抑制作用表現(xiàn)在10和20mg/L治療組延遲了CNV的出現(xiàn)時間并降低了CN

10、V的長度和面積，而5mg/L組則無明顯變化。這些結(jié)果表示K5蛋白對CNV的抑制作用呈劑量依賴性。 1.1.3 K5蛋白滴眼液對CNV退化的作用 在我們的動物模型中，傷后2周CNV形成，此時應(yīng)用K5蛋白滴眼液可明顯促進CNV的退化。 1.1.4 K5蛋白滴眼液的抗炎癥作用 Wilcoxon秩和檢驗發(fā)現(xiàn)，在各個時間點上，10和20mg/L K5治療組炎癥指數(shù)均明顯低于對照組(P均＜0.001)，而10

11、和20mg/L K5治療組組間比較差異無顯著意義(P值均＞0.05)。5mg/L組與對照組比較，差異無顯著意義(P＞0.05)，但與10和20mg/L組相比，差異有顯著意義(P值均＜0.05)。這些結(jié)果提示K5有抗炎癥作用，且呈劑量依賴性。 組織學檢查發(fā)現(xiàn)10和20mg/L組角膜炎癥細胞浸潤均明顯低于5mg/L組與對照組。角膜后膜，一種炎性膜，可在5mg/L組與對照組中觀察到，而在10和20mg/L組則無。組織學研究進一步明

12、確了K5在本模型中的抗炎作用。 1.1.5 兔角膜NV面積與角膜后膜及炎性細胞的相關(guān)性 傷后28天各組兔角膜后膜(層數(shù))、炎性細胞數(shù)分別與角膜NV面積Pearson等級相關(guān)分析顯示，各組角膜NV面積與角膜后膜(層數(shù))及炎性細胞數(shù)呈正相關(guān)。 1.2 K5蛋白抑制角膜新生血管的機制研究 采用免疫組織化學和Western blot方法檢測K5蛋白對角膜組織中VEGF表達水平的影響。原代培養(yǎng)了B

13、AEC，BAFC，VSMC，利用MTT檢測K5蛋白對細胞增殖的影響，用流式細胞儀檢測細胞周期的變化，同時我們還采用電子顯微鏡檢查，DNA片段分析，和TUNEL方法，在體和離體檢測K5蛋白對BAEC凋亡的影響。 1.2.1 K5蛋白下調(diào)角膜VEGF的表達 5mg/L K5組與對照組中可見VEGF在角膜上皮細胞、角膜細胞、內(nèi)皮細胞、增殖的角膜基質(zhì)纖維及CNV壁的某些細胞(如：周細胞和單核細胞)上均呈強陽性表達，還在大

14、量的炎性細胞的胞漿中有強陽性表達。10和20 mg／L K5組可見VEGF在上述部位均有弱陽性表達。 采用免疫沉淀的方法將K5對VEGF表達的作用進行半定量分析，與免疫組織化學的結(jié)果相同，與PBS對照組相比，20mg／L K5滴眼液可降低角膜VEGF的水平5倍(P<0.01)，提示K5可降低堿燒傷后角膜中VEGF的表達。 1.2.2 K5蛋白特異性抑制BAEC的生長 K5蛋白可以劑量和時間依賴的方式

15、抑制BAEC細胞增殖，而對BVSMC或BAFC無作用，提示K5特異性抑制內(nèi)皮細胞的作用。 1.2.3 K5蛋白對BAEC細胞周期的影響 K5蛋白明顯抑制BAEC S期細胞百分比和G2+S／G<,1>，使BAEC在G<,1>期發(fā)生細胞周期停滯。 1.2.4 K5蛋白對BAEC細胞超微結(jié)構(gòu)的影響 80nM K5蛋白明顯改變了內(nèi)皮細胞的形態(tài)，K5治療組的細胞呈球形且具有一些細胞核及細胞質(zhì)的異常。

16、細胞核濃縮是細胞凋亡的一個典型特征，染色質(zhì)濃縮出現(xiàn)于細胞核內(nèi)或細胞核周邊。同時可觀察到不同形態(tài)的異常空泡，其周圍含有細胞碎片，K5治療組的細胞內(nèi)還可看到凋亡小體，進一步證明K5可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的凋亡。 1.2.5 K5蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡 瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，80nM K5可引起典型的DNA碎片(250-bp至300-bp多倍體)，相反，在對照組和20nM，40nM K5組均未見，DNA碎片。TUNEL檢測結(jié)果

17、表明，與對照組比較，20mg／L K5提高了CNV的凋亡內(nèi)皮細胞數(shù)。 第2章 溶血磷脂酸(LPA)在眼表炎癥中的作用 在本研究中，我們假設(shè)LPA在人角膜上皮細胞中充當炎癥介質(zhì)的角色。利用已建立的細胞株作為模型系統(tǒng)，檢測LPA的產(chǎn)生，LPA及炎癥因子的信號反應(yīng)，及LPA受體拮抗劑的作用。 2.1 2.040 pRSV-T角膜上皮細胞產(chǎn)生LPA及不同介質(zhì)對LPA產(chǎn)生的影響 2.2 LPS對LPA產(chǎn)生