多重修飾的明膠—硅氧烷納米粒作為基因載體腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞靶向研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是最常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤，其化療效果欠佳的主要原因就是中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到血腦屏障的保護(hù)。血腦屏障(bloodbrainbarrier，BBB)是由腦內(nèi)毛細(xì)血管的內(nèi)皮和內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接、基膜以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞突起構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)的存在，阻止了極性分子在細(xì)胞旁的自由擴(kuò)散。而且在大腦內(nèi)皮細(xì)胞表面沒(méi)有窗孔、吞飲小泡極少，98％的藥物、外源基因不能透過(guò)血腦屏障達(dá)到良好的藥物濃度。近些年基因治療的廣泛開(kāi)展，為腦膠質(zhì)瘤的治療

2、提供了新的契機(jī)，因此高效性基因載體的研究變成了重中之重。作為非病毒藥物載體中重要的一員，納米粒子發(fā)揮著無(wú)可替代的作用，而其中的明膠-硅氧烷雜化材料，由于具有低毒性、可降解性、表面易修飾性以及易重復(fù)合成等優(yōu)點(diǎn)在提高藥物靶向性方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建一種經(jīng)陽(yáng)離子多肽和適配體共修飾的不但能夠很好的被細(xì)胞攝取并能靶向腦腫瘤細(xì)胞的納米粒子基因載體系統(tǒng)，并考察其攜帶質(zhì)粒DNA在細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)染效率。
　　 本

3、文工作主要分為以下三個(gè)方面:
　　 1.通過(guò)兩步溶膠-凝膠法制備出明膠-硅氧烷納米粒子(gelatin-siloxanenanoparticlesGSNPs)后，通過(guò)靜電吸附作用使得目的基因熒光素酶質(zhì)粒pGL3連接，然后通過(guò)靶向識(shí)別人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的適配體TTA1(5'-CCTGCACTTGGCTTGGATTTCAGAAGGGAGACCC-3')、提高納米粒子穿透血腦屏障和細(xì)胞膜的陽(yáng)離子多肽TAT（YGRKKRRQRRR）

4、、延長(zhǎng)藥物體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的聚乙二醇(Poly(ethyleneglycol)，PEG）對(duì)其進(jìn)行表面修飾。并經(jīng)透射電鏡、熒光光譜儀、Zeta電位儀、粒徑儀等對(duì)其進(jìn)行理化性能分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了適配體TTA1和陽(yáng)離子多肽TAT可以成功連接到納米粒子表面，其納米粒子表面形態(tài)，修飾前后無(wú)明顯差異;但納米粒子直徑，隨著多重修飾的增加，粒徑有不同程度的增大。
　　 2.通過(guò)體外毒性試驗(yàn)對(duì)經(jīng)過(guò)適配體TTA1、陽(yáng)離子多肽TAT、聚乙二醇(PEG)

5、修飾后的明膠-硅氧烷粒子與DNA的復(fù)合物進(jìn)行細(xì)胞生物相容性評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)多重修飾的明膠-硅氧烷納米粒子細(xì)胞毒性較未經(jīng)修飾的該納米粒細(xì)胞毒性增加，當(dāng)各種納米粒子與DNA的復(fù)合物的濃度為100μg/mL時(shí)，與細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，各組細(xì)胞的生存率均達(dá)到了80％及以上。仍然具有較好的生物活性。細(xì)胞內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀進(jìn)行。結(jié)果證實(shí)，經(jīng)TTA1修飾的明膠-硅氧烷納米粒子較未經(jīng)修飾的該納米粒腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞靶向性能優(yōu)越;再經(jīng)陽(yáng)離子多肽

6、TAT修飾后，各組納米粒子的透過(guò)細(xì)胞膜的能力均較前明顯增強(qiáng)，并且可以使攜帶的目的基因在細(xì)胞內(nèi)高效的表達(dá)。
　　 3.通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶（HRP）滲透實(shí)驗(yàn)以及緊密連接蛋白ZO-1的免疫染色檢測(cè)，證實(shí)了可以利用商品化的人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞HCMEC/D3成功構(gòu)建出良好的體外血腦屏障模型(BloodBrainBarriermodel，BBBM)。通過(guò)熒光光譜儀、熒光顯微鏡、化學(xué)發(fā)光儀等多種檢測(cè)方法證實(shí)，經(jīng)TTA1和TAT修飾后的明膠硅氧烷