慢病毒介導(dǎo)的C-jun基因沉默對放射抗拒人鼻咽癌胞系CNE-2R放射敏感性的影響.pdf

1、背景：
　　鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種好發(fā)于東南亞地區(qū)及我國南方各省的常見惡性腫瘤[1]。鼻咽癌患者放療后局部的復(fù)發(fā)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是制約其療效和預(yù)后的瓶頸，放射抗拒是制約鼻咽癌患者5年生存率的關(guān)鍵因素[2，3]。有研究表明，輻射誘導(dǎo)的基因調(diào)控和表達(dá)的差異可能與放射抗拒的發(fā)生有關(guān)[4-7]。因此，尋找能夠早期預(yù)測鼻咽癌輻射敏感性的分子標(biāo)志物對于個體化放射治療具有重要意義。
　　本課題

2、組將前期篩選出與放射抗拒相關(guān)的分子標(biāo)志物進(jìn)行基因本體論(gene ontology)、通路分析(Pathway analysis)及蛋白質(zhì)互做網(wǎng)絡(luò)技術(shù)(Protein interaction network)進(jìn)行綜合分析，從放射抗拒相關(guān)基因或蛋白質(zhì)互做網(wǎng)絡(luò)中獲取多個與輻射抗拒相關(guān)的關(guān)鍵性標(biāo)志物。
　　我們選取在通路構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)上的節(jié)點(diǎn)之一的c-jun作為候選基因，為明確c-jun基因與鼻咽癌放射抗拒之間的相關(guān)性，我們利用RNA干擾技術(shù)

3、抑制放射抗拒人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2R中高表達(dá)的c-jun基因，探究其對CNE-2R細(xì)胞放射敏感性的影響及其潛在機(jī)制。初步探討c-jun基因能否成為鼻咽癌分子治療的新靶點(diǎn)。
　　研究內(nèi)容
　　第一部分 慢病毒shRNA載體構(gòu)建并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CNE-2R細(xì)胞株
　　目的：
　　本課題組前期發(fā)現(xiàn)c-jun基因在放射抗拒細(xì)胞株CNE-2R中呈高表達(dá)，因其涉及多條通路且是基因互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)之一，為明確c-jun基

4、因與鼻咽癌放射抗拒之間的相關(guān)性，我們利用RNAi抑制放射抗拒人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2R中高表達(dá)的c-jun基因，并篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，為探究其對CNE-2R細(xì)胞放射敏感性的影響奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.采用RT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)分別在mRNA及蛋白水平上驗(yàn)證c-jun基因的表達(dá)。
　　2.設(shè)計(jì)合成3組特異性針對c-jun基因的siRNA，構(gòu)建慢病毒shRNA載體，感染CNE-2R細(xì)胞。

5、>　　3.將感染目的細(xì)胞CNE-2R，經(jīng)流式分選獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株，采用RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測各組對目的基因的抑制效果，篩選出沉默效果最佳的靶點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1.RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測c-jun基因的表達(dá)情況與芯片結(jié)果相符。
　　2.經(jīng)測序證實(shí)，3組特異性針對c-jun基因的siRNA，成功構(gòu)建慢病毒shRNA載體，并包裝出滴度為8×108TU/ml。感染CNE-2R

6、細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡下觀察，顯示各組感染效率均在80％以上，感染成功。
　　3.RT-PCR和Western blot篩選出最佳干擾靶點(diǎn)，siRNA序列為:CA AACCTCAGCAACTTCAA。
　　結(jié)論：
　　RNA干擾技術(shù)可有效抑制放射抗拒人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2R中高表達(dá)的c-jun基因，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分 慢病毒介導(dǎo)的C-jun基因沉默對放射抗拒人
　　鼻咽癌CNE-2R細(xì)胞生物

7、學(xué)行為及放射敏感性的影響
　　目的：利用RNA干擾技術(shù)抑制放射抗拒人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2R中高表達(dá)的c-jun基因，觀察c-jun基因沉默后對CNE-2R細(xì)胞的存活能力、周期、凋亡及放射敏感性的影響，了解c-jun基因與鼻咽癌放射敏感性間的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測感染前后細(xì)胞的生長情況，分析c-jun基因沉默前后對CNE-2R細(xì)胞生存率的影響。
　　2.克隆形成實(shí)驗(yàn)測定c-jun基因沉默

8、前后，CNE-2R細(xì)胞放射敏感性的變化。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)0 Gy和2 Gy處理后各組細(xì)胞周期及凋亡率的變化，分析c-jun基因沉默后對CNE-2R細(xì)胞周期及凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1.CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:6MVX射線聯(lián)合c-jun基因沉默組在0、2、4、6和8 Gy照射后細(xì)胞的吸光度OD值均顯著低于未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組(F=42.70～200.67,P＜0.05)。
　　2.克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，

9、c-jun基因沉默組與未轉(zhuǎn)染組及陰性對照組相比，SF2、D0和Dq值均減小，放射增敏比(SERD0)為1.41。
　　3.細(xì)胞周期結(jié)果顯示:0Gy:未轉(zhuǎn)染組、NC組和c-jun-RNAi-LV2實(shí)驗(yàn)組G2/M所占比例分別為18.27±5.28，17.13±3.35，27.33±1.58，c-jun基因沉默組與另兩組相比G2/M所占比例增加(P＜0.05);2Gy:三組G2/M所占比例分別為19.93±4.99，17.63±3.01

10、，28.57±2.9(P＜0.05)。
　　4.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未經(jīng)照射的c-jun基因沉默組與聯(lián)合2 Gy照射的凋亡率分別為（20.93±1.99）％和（38.17±0.83）％，均高于未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組的凋亡率[0 Gy:（10.97±0.70）％和（10.80±1.25）％;2 Gy:（20.43±0.25）％和（19.53±1.50）％;F=50.54、330.14，P＜0.05]。
　　結(jié)論：
　　c