基于T細胞表位肽的樹突細胞介導(dǎo)的靶向性細胞殺傷機制的研究.pdf

1、隨著免疫識別理論、分子生物學(xué)知識和電子顯微技術(shù)的不斷進展與突破，大量研究證實發(fā)現(xiàn)T細胞對于抗原的識別是與MHC分子結(jié)合遞呈的抗原短肽。有效的抗原表位肽可以通過樹突細胞呈遞到MHC-Ⅰ/MHC-Ⅱ途徑引起機體的免疫反應(yīng)。近年來又有科學(xué)家提出復(fù)合表位或改構(gòu)表位可以增強單表位的功能。隨著DC疫苗在臨床的應(yīng)用及其相關(guān)研究的進一步深入，尋找有效的T細胞表位以增強DC疫苗在抗腫瘤及治療感染性疾病的作用受到越來越多的重視。如何使外來抗原通過MHC-Ⅰ

2、途徑誘發(fā)CD8+CTL反應(yīng)是DC在臨床應(yīng)用中的關(guān)鍵。
　　該課題的設(shè)計主要針對病因明確的病毒性疾病，擬選擇以乙型肝炎病毒源性肝炎為疾病模型，以細胞免疫所攻擊的乙型肝炎病毒核心蛋白為靶蛋白，通過軟件預(yù)測的方法分析該蛋白的生物學(xué)特性及T細胞表位肽，將設(shè)計得到的表位修飾并合成。建立可標(biāo)準(zhǔn)化的DC培養(yǎng)平臺；通過實驗探討表位肽對DC功能的影響以及其作用機理，為DC在臨床的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。實驗分為四部分，具體如下：
　　第一部分T細胞表位

3、肽的設(shè)計與篩選
　　目的預(yù)測HBV核心蛋白的一般生物學(xué)特性及該蛋白片段上有效的HLA-2限制性CTL表位。方法從Genebank中選擇B型(adw)HBV的核心蛋白，用軟件CLCProteinWorkbench3版本和SignalP3.0軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/）對HBV核心抗原的編碼蛋白質(zhì)進行預(yù)測的一般生物學(xué)特性；采用SYFPEITHI遠程預(yù)測數(shù)據(jù)庫、PREDE

4、PP數(shù)據(jù)庫、基序法和多項式法共同對HBV核心抗原編碼蛋白進行HLA-A2限制性CTL表位預(yù)測。結(jié)果通過軟件對HBV核心蛋白進行分析，明確了該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)，信號肽，亞細胞定位，抗原性位點。篩選了5條T細胞表位肽。結(jié)論預(yù)測方案的聯(lián)合使用可以提高T細胞表位肽篩選的準(zhǔn)確率。
　　第二部分T細胞表位肽的鑒定、修飾與合成
　　目的鑒定篩選出的5條肽生物學(xué)特性，修飾并合成與抗原結(jié)合性能最好的肽，為進一步探討外源性小分子表位肽進入細胞內(nèi)激

5、發(fā)MHC1類反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。方法用抗原性能結(jié)合實驗分別從親和力、結(jié)合穩(wěn)定性和MHC-肽復(fù)合體穩(wěn)定性三方面鑒定5條表位肽與抗原的結(jié)合性能，篩選出結(jié)合性能最好的兩條肽，并用輔助性T細胞表位、B細胞表位和棕櫚酰基修飾，F(xiàn)moc方案合成。結(jié)果篩選出2條T細胞表位肽，合成9條肽，構(gòu)成11組表位肽。結(jié)論利用抗原結(jié)合性能實驗和Fmoc合成方案可以完成抗原肽的鑒定與合成。
　　第三部分人外周血單核細胞來源的樹突細胞轉(zhuǎn)化平臺的搭建
　　目的建立

6、一種可標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模操作DC培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化及鑒定平臺。方法將人外周血的PBMC用CD14+磁珠標(biāo)記，在磁場中分離出CD14+PBMC；將分選得到的細胞在DC培養(yǎng)袋中加入IL-4，GM-CSF共培養(yǎng)，第10天，收集細胞計數(shù)，Typanlan染色觀察活性，流式細胞儀檢測細胞表型，掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。結(jié)果光學(xué)顯微鏡下，樹突狀細胞懸浮生長，大小不等，形態(tài)極不規(guī)則，向四周伸出不同數(shù)量的粗細不一、形態(tài)迥異的胞質(zhì)突起。CD14+PBMC在初始血液中的比例

7、為14％，而經(jīng)過分離純化后的CD14+細胞的濃度達到94.8％。在培養(yǎng)10天后的細胞懸液中，由于大部分細胞轉(zhuǎn)化為DC，所以分子表面標(biāo)志發(fā)生改變，CD14+細胞的濃度僅為0.65％;在培養(yǎng)出的DC細胞表面高表達HLA-I（70.43％），HLA-Dr(0.65％)，CD80(89.45％)，CD86(86.32％)，部分表達CD40(29.61％)。這些細胞表面分子標(biāo)志都是人PBMC轉(zhuǎn)化為DC后的特征性分子。掃描電鏡可見被固定的樹突狀細胞

8、仍保持其特征性的突起，使細胞呈星狀、多角形或極不規(guī)則形。突起長短不一，分支形成1-4級的亞突起。結(jié)論從PBMC中分離純化的CD14+細胞通過加入細胞因子可以在細胞培養(yǎng)袋中非貼壁式培養(yǎng)出高純度的DC。
　　第四部分DC介導(dǎo)的靶向性殺傷功能及機制的初步探討
　　目的對比負載不同表位肽的DC的生物學(xué)功能篩選出殺傷功能最佳的表位肽組合，從微分子水平探討組合肽的功能性差異。方法用四噻唑藍法實驗檢測細胞毒功能；ELISPOT實驗檢測負載

9、不同表位的DC刺激T細胞分泌γ-IFN的功能；原子力顯微鏡分析DC經(jīng)小分子肽作用后表面精細結(jié)構(gòu)改變；激光共聚焦顯微鏡分析小分子肽進入細胞后不同時間的表現(xiàn)；免疫熒光顯微鏡觀察DC攝取肽的過程。結(jié)果細胞經(jīng)第T1，T1+T2，T1+Th，T1-AAA-Th，pal-KSST1，pal-KSST1AAATh，T1+B，pal-KSST1Th，T1+Th，B組短肽處理后，細胞活性較對照組有顯著性升高（p<0.05），其中第T1+B組肽則可使細胞活

10、性呈現(xiàn)極顯著升高（p<0.01），而經(jīng)T2，Th，T1Th短肽處理后，細胞活性較對照組有顯著性降低（p<0.05），其中第T2組肽使細胞活性呈現(xiàn)極顯著降低。篩選出的表位肽T1可以上調(diào)DC對T細胞刺激能力（P＜0.01），而經(jīng)過棕櫚酰絲氨酸修飾的表位或B細胞、Th協(xié)同的T細胞表位負載DC刺激能力也有同樣表現(xiàn)（P＜0.01），無論輔助性T細胞表位還是B細胞表位對于T1均有協(xié)同作用。將輔助性T細胞表位直接偶聯(lián)到T1表位上，破壞了T1刺激DC的

11、能力。即使在T1表位和Th內(nèi)部通過AAA連接，并以棕櫚酰絲氨酸修飾也不會表現(xiàn)出比單獨的T1表位明顯的功能增強。激光共聚焦的結(jié)果顯示小分子肽可以在30分鐘被DC快速攝取，免疫熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)肽的攝取是在5min內(nèi)完成的；小分子肽的攝取由胞體完成后向樹突傳遞，而且樹突的肽濃度相對胞體較低。小分子肽被細胞攝取后的12h內(nèi)，始終不曾進入細胞核。在透射電鏡下，負載肽的DC線粒體增大，增多，核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富。而MTT活性檢測實驗顯示這些被肽激活的D

12、C的功能上調(diào)。結(jié)論DC經(jīng)不同短肽處理后，細胞活性會產(chǎn)生一定程度的改變。短肽使T淋巴細胞的殺傷活性增高的原因主要是通過DC激活了細胞免疫途徑，發(fā)揮了CTL效應(yīng)。棕櫚?；揎椇罂梢陨险{(diào)T細胞表位的功能；B細胞表位和Th可以通過表位間的協(xié)同作用增強T細胞表位肽激活CTL的效應(yīng)。AFM觀察到細胞表面形貌變化受外源性小分子肽一級結(jié)構(gòu)的影響，而且直接影響細胞的活性。小分子肽不作為遺傳物質(zhì)參與細胞的信息傳遞，這一現(xiàn)象為表位肽作為疫苗，與DC共培養(yǎng)后回