抗人CD105鼠單克隆抗體、紫杉醇高分子聚合體制備及其體外抗腫瘤作用的研究.pdf

1、研究背景:
　　卵巢癌是婦科常見的高危惡性腫瘤,多烯紫杉醇(Docetaxel,TXT)又稱多西他賽是卵巢癌的一線化療藥物。目前常用的TXT溶媒可引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng),同時全身用藥的靶向性不足,從而影響藥物療效,因此需要對TXT的負(fù)載系統(tǒng)進行優(yōu)化改良,以克服藥物副作用,提高藥物治療的有效性,來適應(yīng)臨床的需要。CD105是卵巢癌腫瘤組織新生血管的一個重要標(biāo)志分子,已有研究將其作為化療藥物的靶標(biāo)可以增強藥物的特異性及療效。以聚乳酸(PL

2、A)為主鏈聯(lián)合,聯(lián)合聚乙二醇(PEG)及生物素的納米顆粒(TXT-BPLANPs)有著良好的TXT載體表征。因此,我們在前期課題研究(特異性抗CD105單克隆抗體雜交瘤細胞株的研制)的基礎(chǔ)上,對特異性CD105單克隆抗體進行了純化制備與鑒定,并對其進行生物素化。同時與重慶大學(xué)課題組合作,將其接合到TXT-BPLANPs載體上,研究TXT-BPLANPs的表征及抗體-BPLA對CD105抗原的靶向結(jié)合力,并以人卵巢癌細胞SKOV3為模型,

3、研究負(fù)載多烯紫杉醇新型TXT-BPLANPs的體外抗腫瘤作用,初步探討其抑制腫瘤生長及促凋亡機制,為TXT抗腫瘤藥的進一步開發(fā)應(yīng)用、降低副作用并提高化療效果提供新思路及實驗依據(jù)。
　　研究方法:
　　采用小鼠腹水接種的方法生成了抗人CD105鼠單克隆抗體,測定了該抗體的效價和親和力,選擇親和力最高的抗體標(biāo)記生物素。以聚乳酸(PLA)為主鏈聯(lián)合,聯(lián)合聚乙二醇(PEG)及生物素合成生物素接枝改性聚乳酸納米顆粒(BPLANPs)。

4、采用成熟的生物素-親和素體系,以親和素為橋梁,實現(xiàn)BPLA材料與抗體的連接,制備抗體-BPLANPs。BPLANPs通過自乳化/溶劑擴散技術(shù)對TXT進行包裹,制備成新型生物素接枝改性聚乳酸-多烯紫杉醇納米粒(TXT-BPLANPs),并對其表征。以不同劑量TXT-BPLANPs(1、10、100、1000、10000nmol/L)處理SKOV3細胞不同時間(12、24、48、72、96、120h)后用CCK-8法測定細胞生長抑制率,流式

5、細胞儀檢測細胞凋亡率,Westernblot檢測Caspase-3表達。
　　研究結(jié)果:
　　1.6株抗人CD105鼠單克隆抗體純化的抗體總量在70~121mg之間,平均產(chǎn)量為2.2~3.1mg/mL,其中1-H9、2-G4及2-G9效價達到1:100萬以上,2-G9的親和力為3.36×1010。選擇2-G9抗體株與生物素結(jié)合,結(jié)合率為1.9。
　　2.BPLANPs的平均粒徑161.6nm(范圍100~300nm),

6、分散系數(shù)PDI為0.117,平均Zeta電位為-37.56mV。BPLANPs對TXT的平均包裹率為54.91％,平均載藥量為11.03%。TXT-PPLA載藥納米粒的2h時TXT的累積釋放率為25%,未出現(xiàn)突釋現(xiàn)象;8h時累積釋放率為51%,達到半數(shù)釋放;12h后藥物釋放進入中期擴散階段,釋放速率變緩,過程平穩(wěn),96h釋放率為64%?？贵w-BPLA可以在體外與CD105特異性結(jié)合,具有體外靶向性。
　　3.在10~10000nm

7、ol/L濃度范圍內(nèi),相同時間點下,TXT和TXT-BPLANPs對SKOV3細胞生長的抑制率均呈現(xiàn)出劑量依賴性。在相同濃度下,TXT組在24h和48h對SKOV3細胞的生長抑制率、凋亡率及capase-3的表達均明顯高于TXT-BPLANPs組(P<0.05);72h后,TXT-BPLANPs組對SKOV3細胞的生長抑制率、凋亡率及capase-3的表達均明顯高于TXT組(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.使用小鼠腹水接

8、種法可以高效的生產(chǎn)特異性的鼠抗人CD105單克隆抗體。
　　2.鼠抗人CD105單克隆抗體由于其對腫瘤新生血管的特異性標(biāo)志物的高親和力可以用于抗腫瘤藥物的靶向引導(dǎo)劑。
　　3.BPLA材料本身制得的納米空球在體外對細胞沒有毒性,且粒徑均勻及攜帶負(fù)電荷的特性,是一種安全高效的TXT藥物載體。
　　4.BPLA能夠有效包裹TXT,實現(xiàn)TXT的緩慢釋放,且有著較高的包裹率及載藥量。
　　5.以親和素為橋梁可實現(xiàn)BPLA