急性肺損傷肺水清除的機制與干預以及P38MAPK信號轉導通路調控研究.pdf

1、目的：
　　檢測急性肺損傷大鼠(油酸型)的肺血管通透性指標、支氣管肺泡灌洗液(Bronchalveolar1avagefluid,BALF)中炎癥因子、肺組織的病理形態(tài)特征以及鈉通道α亞單位mRNA(α-ENaCmRNA)、Na+-K+-ATP酶(sodium-potassiumATPenzyme,Na+-K+-ATPase)、P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)信號轉導通路在肺組織中的表達，并予小劑量地塞米松及P38MAP

2、K抑制劑SB203580干預，探討急性肺損傷(油酸型)肺水清除機制以及早期小劑量地塞米松對急性肺損傷(油酸型)大鼠肺泡鈉水轉運系統(tǒng)的影響，探討在急性肺損傷(油酸型)中P38MAPK信號通路的作用及調控機制，為早期小劑量的地塞米松及SB203580干預急性肺損傷提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　雄性、健康、成年SD大鼠通過右頸靜脈注射油酸0.20ml/kg，建成急性肺損傷模型，動物進行隨機分組。實驗1：對照組、油酸模型組和地塞米

3、松干預組，大鼠均在建模6h后處死；實驗2：對照組、油酸模型組和SB203580干預組，大鼠均在建模4h后處死。觀察急性肺損傷(油酸型)大鼠一般情況，蘇木精-伊紅(hematoxylin–eosin，HE)染色檢測肺組織的病理特征，予干濕重方法測肺組織含水率、肺濕干重（W/D），檢測肺系數(shù)（Lungindex，LI），予蛋白測定方法計算肺通透性指數(shù)（lungpermeabilityindex,LPI），予酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）去測B

4、ALF中的炎癥因子腫瘤壞死因子-α(Tumornecrosisfactor-α，TNF-α)及白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)含量，予比色法測肺組織的髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，RT-PCR測定肺組織的α-ENaCmRNA表達，肺組織Na+-K+-ATP酶活性予生化法測定，免疫組織化學方法和蛋白質免疫印跡方法用來測定肺組織p38MAPK、磷酸化p38MAPK（phosphorylat

5、edp38MAPK，P-p38MAPK）的表達，測定光密度值用圖像分析儀測定。
　　結果：
　　1．急性肺損傷(油酸型)大鼠的一般情況及呼吸頻率的檢查
　　對照組一般情況好，在實驗前后無紫紺，行為學及呼吸頻率無異常變化。油酸模型組(4h)以及油酸模型組(6h)大鼠均出現(xiàn)了呼吸急促、紫紺，精神狀態(tài)萎靡、煩躁、不愿行動、予刺激時的反應差；在部分大鼠的口鼻處出現(xiàn)了血性的分泌物及肉眼血尿。地塞米松以及SB203580干預組大鼠

6、在注入油酸開始的時候均表現(xiàn)為呼吸增快，隨后出現(xiàn)呼吸平穩(wěn)，逐漸增加活動。
　　實驗1中，與對照組的呼吸頻率(81.13±2.23)次/分相比較，油酸模型組(6h)大鼠的呼吸頻率(145.50±6.19)次/分出現(xiàn)了明顯增快(P﹤0.01)；與油酸模型組相比較,地塞米松干預組呼吸頻率(108.38±3.20)次/分出現(xiàn)明顯減慢(P﹤0.01)。
　　實驗2中，與對照組的呼吸頻率(85.13±4.02)次/分相比較，油酸模型組(4

7、h)的大鼠呼吸頻率(138.63±6.61)次/分增快明顯(P﹤0.01)；與油酸模型組比較,SB203580干預組呼吸頻率(116.75±5.99)次/分則明顯減慢(P﹤0.01)。
　　2．肺濕干重、肺組織含水率、肺系數(shù)、肺通透指數(shù)的檢測
　　與對照組相比，油酸模型組(4h)及油酸模型組(6h)的檢測指標:肺濕干重、肺組織含水率、肺系數(shù)、肺通透指數(shù)均出現(xiàn)明顯升高(P﹤0.01)，而地塞米松及SB203580干預組上述指標

8、則均較油酸模型組明顯降低(P﹤0.01)。
　　實驗1中，予干濕重法檢測肺的濕干重,從對照組的(4.46±0.15)升高至油酸模型組的(6.37±0.62)(P﹤0.01),肺組織含水率從對照組的(77.58±0.74)％升高至油酸模型組的(84.30±1.47)%(P﹤0.01)；肺系數(shù)也出現(xiàn)明顯升高，從對照組的(0.54±0.26)×10-2升高至油酸模型組的(1.13±0.17)×10-2(P﹤0.01)。肺通透指數(shù)從對照組

9、的(1.36±0.06)×10-3升至油酸模型組的(4.75±0.14)×10-3(P﹤0.01)；而地塞米松干預組的肺濕干重（5.07±0.22）、肺組織含水率（80.27±0.86）%、肺系數(shù)（0.81±0.06）×10-2、肺通透指數(shù)（2.73±0.08）×10-3均較油酸模型組明顯降低(P﹤0.01)。
　　實驗2中，油酸模型組肺組織含水率及肺濕干重均升高明顯，肺濕干重從對照組的(4.51±0.14)升高至油酸模型組的(6

10、.06±0.33)(P﹤0.01)，肺組織含水率從對照組的(77.81±0.71)%升高到油酸模型組的(83.49±0.88)%(P﹤0.01)；肺系數(shù)也升高明顯，從對照組的(0.56±0.07)×10-2升至油酸模型組的(1.08±0.10)×10-2(P﹤0.01)。肺通透指數(shù)從對照組的(1.33±0.07)×10-3升至油酸模型組的(4.54±0.12)×10-3(P﹤0.01)；而SB203580干預組的肺濕干重（5.30±0.

11、17）、肺組織含水率（81.15±0.86）%、肺系數(shù)（0.87±0.07）×10-2、肺通透性指數(shù)（2.81±0.10）×10-3均較油酸模型組明顯降低(P﹤0.01)。
　　3．肺組織MPO活性以及BALF中炎癥因子TNF-α、IL-6含量檢測
　　實驗1中，油酸模型組肺組織MPO活性及BALF中炎癥因子IL-6含量均比對照組明顯升高(P﹤0.01)；肺組織MPO活性從對照組的(1.74±0.14)u/g升至油酸模型組的

12、(6.81±0.25)u/g(P﹤0.01)；BALF中炎癥因子IL-6含量從對照組的(67.08±7.51)pg/ml上升至油酸模型組的(280.07±20.84)pg/ml(P﹤0.01)；而地塞米松干預組肺組織MPO活性（3.62±0.19）u/g及BALF中IL-6含量（147.98±14.24）pg/ml均較油酸模型組降低明顯(P﹤0.01)。
　　實驗2中,與對照組BALF中炎癥因子TNF-α含量（53.63±5.61

13、）pg/ml比較，油酸模型組BALF中TNF-α含量（261.80±21.02）pg/ml則出現(xiàn)明顯升高(P﹤0.01)，而SB203580干預組BALF中TNF-α含量（158.74±14.30）pg/ml較油酸模型組降低明顯(P﹤0.01)。
　　4．肺組織病理形態(tài)學檢測
　　予肉眼觀察對照組，見雙肺表面光滑呈粉色；光鏡下看HE染色的肺組織切片，可見無明顯分泌物在肺泡腔內，肺泡壁的結構完整，無炎性細胞浸潤。油酸模型組（4

14、h）油酸模型組（6h）大鼠均出現(xiàn)了雙肺腫脹,滲血及點狀出血出現(xiàn)在肺組織表面，淡紅和暗紅相間，當切開肺組織的時候,可以見到有較多淡粉色泡沫液體滲出；光鏡下觀察，肺間質及肺泡出現(xiàn)水腫，大量炎細胞浸潤，大量滲出液(富含蛋白)在肺泡腔內，部分肺泡結構破壞。地塞米松及SB203580干預組大鼠肺組織均表現(xiàn)為輕度腫脹，肺表面的出血點及肺泡內泡沫狀液體比油酸模型組少；在光鏡下觀察，治療組肺組織的損傷程度較油酸模型組明顯減輕。
　　5．肺組織鈉水

15、轉運系統(tǒng)的檢測
　　在實驗1中，與對照組相比較,油酸模型組肺組織α-ENaCmRNA表達及Na+-K+-ATP酶活性均明顯降低(P﹤0.01)，而地塞米松干預組的上述指標則均較油酸模型組升高明顯(P﹤0.01)。
　　肺組織的α-ENaCmRNA的相對豐度(油酸模型組)從對照組的(1.06±0.06)下降到油酸模型組的(0.44±0.02)(P﹤0.01)；生化方法測肺組織Na+-K+-ATP酶的活性，肺組織的Na+-K+-

16、ATP酶活性(油酸模型組)降低明顯，從對照組的(4.74±0.10)μmolpi/mgprot/hour下降到油酸模型組的(3.05±0.18)μmolpi/mgprot/hour(P﹤0.01)；地塞米松干預組中的肺組織α-ENaCmRNA的相對豐度（0.77±0.06）及Na+-K+-ATP酶的活性（4.06±0.12）μmolpi/mgprot/hour則均較油酸模型組升高明顯(P﹤0.01)。
　　6．肺組織中P38MAP

17、K信號轉導通路的檢測
　　實驗2中，肺組織P-P38MAPK表達用免疫組織化學法測定，肺組織的免疫組化切片結果顯示P-P38MAPK蛋白陽性反應的細胞均表現(xiàn)為胞漿、胞核染色，內有棕黃色圓形顆粒。對照組肺組織內的P-P38MAPK蛋白陽性細胞較少，分布于氣道粘膜上皮及肺泡上皮細胞；肺組織P-P38MAPK蛋白陽性細胞在油酸模型組較多，在肺泡上皮細胞、血管內皮細胞、氣道上皮細胞、浸潤炎癥細胞廣泛分布；SB203580組肺組織P-P38

18、MAPK蛋白陽性細胞則較油酸模型組明顯減少。
　　實驗2中，肺組織P38MAPK、P-P38MAPK的蛋白表達Westernblot測定，與對照組(0.23±0.02)相比，油酸模型組P-P38MAPK蛋白相對含量(0.79±0.02)增加明顯；與油酸模型組相比較，SB203580組P-P38MAPK蛋白的相對含量(0.39±0.01)則出現(xiàn)了明顯降低。各組P38MAPK蛋白及GAPDH表達在實驗的各組均無差異。
　　結論：

19、
　　1.肺組織α-ENaCmRNA的表達及Na+-K+-ATPase的活性下調為肺損傷發(fā)生肺水腫的一個重要機制；早期小劑量的地塞米松可以通過抑制炎癥因子，降低肺上皮-內皮屏障的通透性，上調α-ENaCmRNA表達以及增加Na+-K+-ATPase的活性而促進肺水清除，減輕肺水腫，對急性肺損傷具肺保護作用。
　　2.肺組織中的P38MAPK激酶被油酸型急性肺損傷激活，且活化的P38MAPK激酶參與了調控炎癥因子，增加了肺水腫