氧化應(yīng)激狀態(tài)下肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞修復(fù)存活、凋亡的變化及p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子機(jī)制.pdf

1、目的:氧療是一種臨床常用治療手段，挽救了大量新生兒的生命，但可帶來(lái)由于持續(xù)用氧治療后的一種肺氧化應(yīng)激性損傷疾病-支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar type Ⅱ epithelial cell，AT-Ⅱ)為肺泡上皮的干細(xì)胞，肺泡上皮的修復(fù)完全依賴(lài)AT-Ⅱ的增殖、分化為肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞(alveolar type Ⅰ epithelial cell，AT-Ⅰ

2、)。BPD的發(fā)生發(fā)展與AT-Ⅱ增殖、存活和凋亡密切相關(guān)。而p38蛋白激酶(p38 MAP kinase，p38MAPK)為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路三個(gè)主要的亞家族之一，與細(xì)胞增殖、存活和凋亡密切相關(guān)。本文以體外培養(yǎng)的大鼠原代AT-Ⅱ?yàn)檠芯繉?duì)象，以不同濃度過(guò)氧化氫(H<,2>O<,2>)處理AT-Ⅱ，探討活性氧(reactive oxygen species，

3、ROS)誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞存活、凋亡及p38MAPK對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下AT-Ⅱ修復(fù)存活，凋亡的調(diào)控作用。 方法:以免疫粘附法分離純化清潔級(jí)Spraque-Dawley成年大鼠AT-Ⅱ，臺(tái)盼蘭拒染法鑒定細(xì)胞活性，改良巴氏染色法鑒定細(xì)胞純度，電鏡直接觀察AT-Ⅱ細(xì)胞形態(tài)為細(xì)胞培養(yǎng)物定性。采用過(guò)氧化氫(H<,2>O<,2>)處理模擬機(jī)體ROS攻擊AT-Ⅱ的體內(nèi)情況，建立氧化性細(xì)胞損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(加無(wú)血清培養(yǎng)基)、H<,2>O<,

4、2>處理組(無(wú)血清培養(yǎng)基中含10、100、500和1000μMH<,2>O<,2>)和p38MAPK干預(yù)組(加p38MAPK抑制劑SB203580)。采用倒置顯微鏡、透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，以四甲基偶氮唑鹽酶反應(yīng)比色法(MTT法)檢測(cè)細(xì)胞存活率，Annexin-V和PI雙染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westem blot)檢測(cè)H<,2>O<,2>處理后AT-Ⅱ細(xì)胞磷酸化p3 8MAPK(Phospho-p38M

5、APK，p-p38MAPK)的表達(dá)，并觀察p38MAPK特異性抑制劑SB203580干預(yù)后細(xì)胞存活率和凋亡率的變化及p-p38MAPK表達(dá)的變化。 結(jié)果:以胰蛋白酶分離，免疫粘附法純化建立AT-Ⅱ原代培養(yǎng)的方法可收獲細(xì)胞1-2×10<'7>個(gè)/鼠，純度和活性>90％。電鏡觀察培養(yǎng)40小時(shí)的細(xì)胞，可見(jiàn)AT-Ⅱ細(xì)胞特征性結(jié)構(gòu)——嗜鋨性板層小體。H<,2>O<,2>處理AT-Ⅱ 180min，與對(duì)照組比較，10μMH<,2>O<,2>

6、處理組的細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異；100μMH<,2>O<,2>處理組細(xì)胞間隙稍增寬；500μMH<,2>O<,2>處理組細(xì)胞間隙增寬，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞皺縮，胞內(nèi)可見(jiàn)空泡；1000μMH<,2>O<,2>處理組貼壁細(xì)胞數(shù)量大大減少，細(xì)胞皺縮明顯，可見(jiàn)脫壁細(xì)胞和細(xì)胞碎片，同時(shí)透射電鏡下觀察到凋亡細(xì)胞的凋亡小體。MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，10μM和100μMH<,2>O<,2>攻擊AT-Ⅱ 180min，細(xì)胞存活率和凋亡率與對(duì)照組比

7、較無(wú)明顯變化(P>0.05)，而500μM和1000μMH<,2>O<,2>攻擊AT-Ⅱ可使細(xì)胞存活率由對(duì)照組的97.50±2.588％降至80.67±6.121％和44.50±2.429％(P<0.05)，凋亡率由7.8960±4.4065％增至29.2420±4.2045％和48.8800±8.6261％(P<0.05)。使用p38MAPK抑制劑SB203580干預(yù)后500μMH<,2>O<,2>處理AT-Ⅱ 180min，與單純5

8、00μMH<,2>O<,2>處理組比較，AT-Ⅱ貼壁細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞皺縮明顯，可見(jiàn)脫壁細(xì)胞和細(xì)胞碎片，AT-Ⅱ存活率更加降低(P<0.05)和凋亡率進(jìn)一步增高(P<0.05)。另外，H<,2>O<,2>可刺激p-p38MAPK陽(yáng)性表達(dá)，以刺激15min表達(dá)最強(qiáng)。p38MAPK抑制劑SB203580能有效阻斷H<,2>O<,2>刺激下p-p38MAPK的陽(yáng)性表達(dá)。 結(jié)論： 1．以胰蛋白酶分離、免疫粘附