免疫性血小板減少癥患者骨髓間質(zhì)細胞及樹突狀細胞免疫功能異常的研究.pdf

1、第一部分沙利度胺糾正ITP患者骨髓間質(zhì)細胞誘導調(diào)節(jié)性樹突狀細胞功能的研究
　　研究背景:
　　免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenia，ITP)是臨床上最為常見的一種自身免疫性出血性疾?。ㄍ庵苎“逵嫈?shù)＜100×109/L）。ITP患者臨床癥狀主要表現(xiàn)為皮膚黏膜出血，內(nèi)臟出血，以及致死性顱內(nèi)出血。目前ITP的發(fā)病機制研究熱點主要分為血小板破壞增多以及血小板生成不足兩部分。經(jīng)典的體液免疫機制提出，I

2、TP患者血小板糖蛋白(Glycoprotein，GP)特異性的自身抗體的產(chǎn)生不但加速了血小板破壞同時還減少了血小板的生成。細胞免疫方面的研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者T輔助細胞(T helper lymphocyte，Th)中Th1/Th2細胞亞群平衡失調(diào)，調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cells，Treg）功能障礙數(shù)量異常，細胞毒性T細胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)直接介導的血小板破壞以及Th17細胞過度增

3、殖活化均直接參與了ITP患者的病理生理過程。近期研究發(fā)現(xiàn)ITP患者骨髓間質(zhì)細胞的增殖及免疫功能異常為ITP發(fā)病機制研究及治療提供了新的思路。
　　骨髓間質(zhì)細胞(Mesenchymal stem cells，MSC)發(fā)現(xiàn)與40年前，是一種非造血并具有多向分化功能的干細胞。體外培養(yǎng)的MSC主要表達一些非特異性表面標志如:CD105，CD73，CD166，CD44，CD90，CD271以及CD29等，并且具有分化為脂肪細胞，成骨細胞，軟

4、骨細胞的能力。MSC在固有免疫以及適應性免疫中的作用備受關注。MSCs可以直接干預固有免疫中的補體、Toll樣受體(Toll-like receptor)、巨噬細胞(Macrophage，M(O))、樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)、肥大細胞以及自然殺傷細胞的功能。在適應性免疫中，MSC可以直接抑制T細胞的功能、調(diào)節(jié)Th細胞的平衡、誘導Treg，并且可以調(diào)控B細胞以及抗原提呈細胞(Antigen presenting c

5、ell，APC)的功能。MSC在維持免疫耐受中具有顯著地作用，其可以阻斷APC與T細胞之間的抗原遞呈并可以誘導APC向調(diào)節(jié)性DC方向分化，進而抑制免疫效應細胞的激活增殖。ITP患者的MSC是否依然具有誘導APC向調(diào)節(jié)性方向分化的能力尚不清楚。
　　目前ITP患者一線治療藥物主要以糖皮質(zhì)激素、靜脈注射用免疫球蛋白（Intravenous immune globulin G，IVIg）為主，然而有近1/3的患者無效或反復發(fā)作。二線治療

6、藥物主要有美羅華（Rituximab）、促血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)、羅米司亭(Romiplostim)以及艾曲波帕(Eltrombopag)等新生藥物組成，用于治療經(jīng)糖皮質(zhì)激素類藥物、免疫球蛋白治療無效的患者，但是治療費用昂貴。沙利度胺(Thalidomide，THD)曾用作非巴比妥酸鹽藥物鎮(zhèn)靜催眠藥，作為一種免疫抑制劑，目前沙利度胺廣泛用于:類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、干燥綜合征、移植物抗宿主病(GvHD)

7、、克羅恩病等免疫相關性病。2004年Falco等利用沙利度胺成功的治愈了一位伴發(fā)多發(fā)性骨髓瘤的ITP患者。迄今為止，沒有與ITP相關的MSC誘導調(diào)節(jié)性DC研究的報道以及THD對ITP患者MSC免疫功能的影響的報道。
　　研究目的:
　　檢測正常對照與ITP患者MSC的增殖能力，抑制淋巴細胞激活的能力以及誘導調(diào)節(jié)性DC的能力差異。檢測THD干預前后，ITP患者MSC增殖能力的變化及其分子生物學機制以及對淋巴細胞激活的能力和誘導

8、調(diào)節(jié)性DC能力的變化。檢測TIEG基因在MSC誘導調(diào)節(jié)性DC中的作用。探討THD糾正ITP患者MSC功能異常的可能機制。
　　研究方法:
　　1.細胞增殖實驗(CCK8):健康對照以及ITP患者的MSC種板后加入不同濃的THD(0，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50mg/mL)培養(yǎng)3天，應用CellCountingKit-8(CCK8)試劑盒檢測并比較健康對照以及ITP患者MSC細胞增殖情況的變化。
　　2.

9、細胞凋亡實驗(Annexin Ⅴ/7AAD):健康對照以及ITP患者的MSC種板后加入THD培養(yǎng)3天，應用Annexin Ⅴ fluorescein isothiocyanate/7-amino-actinomycin D(Annexin Ⅴ/7-AAD)試劑盒檢測并比較健康對照以及ITP患者MSC細胞凋亡情況的變化。
　　3.細胞周期實驗(PI):健康對照以及ITP患者的MSC種板后加入THD培養(yǎng)3天，應用碘化丙啶(propid

10、ium iodide，PI)試劑盒檢測并比較健康對照以及ITP患者MSC細胞周期情況的變化。
　　4.表達芯片:ITP患者的MSC種板后加入THD培養(yǎng)12小時，應用Human Genome Array(Capital Bio Corp)檢測并比較ITP患者MSC在THD干預前后表達基因譜的變化，尋找THD干預前后的差異基因。
　　5.差異性表達基因驗證實驗:健康對照以及ITP患者的MSC種板后加入THD培養(yǎng)12小時，實時熒光

11、定量法(real-time reverse-transcription polymerase chain reaction，real-timeRT-PCR)鑒證表達芯片中篩選的差異基因。
　　6.MSC抑制試驗:健康對照以及ITP患者的MSC經(jīng)過THD干預前后，分別與同種異基因的佛波酯(phorbolmyristate acetate，PMA)激活的琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succi

12、nimidyl ester，CFSE)標記的CD4+T細胞、同種同基因的DC共培養(yǎng)。流式細胞術檢測T細胞的增殖情況用以檢測健康對照以及ITP患者的MSC抑制功能的差異以及THD對MSC抑制功能的影響。
　　7.調(diào)節(jié)性DC抑制功能試驗:mDC與健康對照以及ITP患者的MSC以及THD干預后的MSC共培養(yǎng)后，經(jīng)過免疫磁珠分選，再與同種異基因的PMA激活的CFSE標記的CD4+T細胞、同種同基因的DC共培養(yǎng)。流式細胞術檢測T細胞的增殖情

13、況用以檢測健康對照以及ITP患者的MSC誘導調(diào)節(jié)性DC功能的差異以及THD對MSC誘導調(diào)節(jié)性DC功能的影響。
　　8.培養(yǎng)上清細胞因子檢測:健康對照以及ITP患者的MSC經(jīng)過THD干預前后分別與同種異基因的CD4+T細胞、同種同基因的DC共培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)上清中的IL-4、IFN-r、IL-12、IDO、TGF-β、IL-10蛋白應用酶聯(lián)免疫吸附實驗試(enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELIS

14、A)法檢測。
　　9.DC成熟度檢測:mDC與健康對照以及ITP患者的MSC以及THD干預后的MSC共培養(yǎng)后，標記CD80，CD86流式抗體，上機檢測THD干預MSC前后對共培養(yǎng)體系中DC細胞的成熟度的影響。
　　10.慢病毒干擾試驗:健康對照MSC分別與TIEG1病毒干擾前后的DC共培養(yǎng)。然后經(jīng)過免疫磁珠法分選出mDC、MSC-DC、MSC-DC、(TIEG1 shRNA)、MSC-DC（control shRNA）分別與

15、同種異基因的CD4+T細胞共培養(yǎng)。流式細胞術檢測T細胞的增殖情況用以驗證TIEG1基因在MSC誘導調(diào)節(jié)性DC中的作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.THD可以顯著地促進ITP患者MSC的增殖能力，并且在0.1μg/mL到10μg/mL濃度區(qū)間呈現(xiàn)濃度依賴性遞增。但當THD濃度大于10μg/mL時對MSC具有抑制性作用。ITP患者MSC處于S+G2期的細胞比例較正常人明顯減低，經(jīng)過THD干預之后其比例顯著上升。正常人與ITP患者的

16、MSC凋亡率無明顯差別，THD干預之后可以明顯的降低二者的細胞凋亡率。
　　2.THD干預前后表達芯片的結(jié)果顯示p27、p16、caspase-8、caspase-10、klf4、c-myc、oct3/4以及TGF-β與THD的干預密切相關。THD干預后ITP患者MSC的caspase-8、caspase-10基因明顯下調(diào)，而正常人的無明顯變化。THD干預后正常人和ITP患者的c-myc基因均顯著下調(diào)。THD干預后，ITP患者的o

17、ct3/4、TGF-β基因顯著上調(diào)，而正常人無明顯變化。在正常人中klf4基因上調(diào)、p27基因下調(diào)而在ITP患者中無明顯差別。p16基因在THD干預前后在正常人與ITP患者中均無明顯變化。
　　3.MSC抑制試驗結(jié)果顯示:正常人與ITP患者的MSC均不能獨自抑制PMA激活的CD4+T細胞增殖。正常人MSC能夠明顯抑制mDC激活的CD4+T細胞增殖但ITP患者MSC失去了抑制mDC激活的CD4+T細胞增殖能力，THD干預后的MSC恢

18、復了抑制功能。正常人及THD干預后的ITP患者MSC均可以通過DC部分的抑制PMA激活的CD4+T細胞。
　　4.調(diào)節(jié)性DC抑制性試驗顯示:正常人MSC誘導的調(diào)節(jié)性DC以及THD干預后的ITP患者MSC誘導的調(diào)節(jié)性DC均失去了激活CD4+T的能力，但是ITP患者的MSC誘導的DC細胞例外。雖然所有條件下誘導的調(diào)節(jié)性DC均無法單獨的顯著的抑制PMA激活的CD4+T的增殖。但是正常人MSC誘導的調(diào)節(jié)性DC以及THD干預后的ITP患者M

19、SC誘導的調(diào)節(jié)性DC均可以顯著的抑制同種異基因mDC激活的CD4+T細胞的增殖，然而ITP患者的MSC誘導的DC失去了這種功能。
　　5.正常人MSC與THD干預后的ITP患者的MSC和mDC共培養(yǎng)后均可以下調(diào)CD80、CD86的表達，而與ITP患者共培養(yǎng)的DC無明顯變化。
　　6.細胞培養(yǎng)上清中，THD干預后組上清中的IL-4、IDO表達量較干預前明顯增多;IL-12、IFN-γ表達量明顯較少。另外與單獨的DC培養(yǎng)上清以及

20、THD干預前MSC/DC共培養(yǎng)上清相比，THD干預后MSC與DC共培養(yǎng)后可以明顯提高上清中IL-10、TGF-β的表達量。
　　7.慢病毒干擾實驗結(jié)果顯示，MSC與干擾TIEG1基因后的DC共培養(yǎng)，無法誘導其向至耐受性方向分化。MSC誘導調(diào)節(jié)性DC是TIEG1依賴性的。
　　結(jié)論:
　　1.ITP患者MSC的增殖能力較正常人明顯減低。THD干預后可以明顯的恢復ITP患者MSC的增殖能力，促使其向S+G2其轉(zhuǎn)化并減低其凋

21、亡率。
　　2.ITP患者的MSC的免疫抑制功能障礙，THD干預后部分的恢復ITP患者MSC直接的免疫抑制功能，并能糾正ITP患者MSC誘導調(diào)節(jié)性DC的能力。
　　3.MSC誘導調(diào)節(jié)性DC的是TIEG1依賴性的。
　　第二部分CD205在ITP患者樹突狀細胞中的表達及大劑量地塞米松對其調(diào)控作用的研究
　　研究背景:
　　樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)在1973年首次被Steinman發(fā)現(xiàn)并

22、報道。作為抗原遞呈細胞，DC廣泛分布在全身各組織器官，捕捉內(nèi)吞處理異?？乖⑴c主要組織相容性復合體一類分子和二類分子結(jié)合分別遞呈給CD4+T細胞和CD8+T細胞，在維持機體自身免疫平衡及阻止病理性自身免疫性疾病中發(fā)揮著至關重要的作用。DC通過自身表達的不同受體來區(qū)分自體抗原以及異體抗原，其可以通過C型選擇素受體(C-type lectin receptors，CLRs)識別自身抗原，如:糖蛋白或者通過Toll樣受體(Toll-like

23、receptors，TLRs)識別異己抗原，如:微生物抗原。免疫穩(wěn)態(tài)下，抗原與特定的CLRs結(jié)合后經(jīng)由DC遞呈，通常會誘導特異性的免疫耐受。CD205主要表達在DC細胞，是目前知之甚少的CLRs家族成員之一，CD205在維持機體對自體抗原的免疫耐受中發(fā)揮著重要作用。免疫穩(wěn)態(tài)情況下，自身抗原在CD205介導下誘導T細胞的特異性耐受。并且CD205+DC細胞可以誘導Foxp3-CD4+T向Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T

24、cell，Treg)方向分化。相關研究表明免疫性血小板減少癥患者(Immune thrombocytopenia，ITP)的DC激活同種異基因T細胞的能力較正常人明顯增高。但是CD205在ITP患者DC中表達的情況尚未有報道。
　　ITP是一種常見的自身免疫性疾病，其主要特征之一是抗自身血小板糖蛋白抗原(platelet glycoproteins，GPs)抗體介導的血小板破壞增多。作為CLRs家族的成員，CD205可能參與了DC

25、識別并捕捉自身GPs的過程。目前，糖皮質(zhì)激素作為ITP的一線用藥，大劑量地塞米松(highdose dexamethasone，HD-dexa)沖擊療法的治療效果已備受認可。HD-dexa可以通過調(diào)節(jié)FcγR的平衡減低單核細胞的吞噬功能以及調(diào)節(jié)患者Th1/Th2細胞平衡糾正ITP患者的異常免疫狀態(tài)。但是應用HD-dexa治療方案對ITP患者DC細胞的抗原遞呈功能、對DC成熟狀態(tài)的影響以及對DC表達CD205的作用仍未明確。
　　脾

26、臟是人類重要的免疫器官，免疫應答及免疫耐受均離不開脾臟的功能。在ITP患者中，脾臟是ITP患者血小板破壞的主要器官之一。近期研究發(fā)現(xiàn)脾臟中淋巴小結(jié)正是ITP患者自身抗原與T細胞接觸激活之處。ITP患者脾臟中DC細胞的分布情況以及DC細胞表達CD205的情況尚未清楚。
　　研究目的:
　　檢測并比較CD205在ITP患者與正常人成熟與未成熟DC細胞中表達的差別。檢測并比較HD-dexa對ITP患者與正常人DC成熟狀態(tài)的影響以及

27、CD205表達的影響。檢測CD205表達量與糖皮質(zhì)激素之間的關系。檢測并比較ITP患者與正常人脾臟CD205+DC細胞的組織分布。
　　研究方法:
　　1.DC細胞的培養(yǎng):抽取正常人與ITP患者外周血，F(xiàn)icoll法分選外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。用CD14+免疫磁珠篩選CD14+細胞后，用含有10％胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)的

28、RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞并種板。每孔加入終濃度為1000u/mL的白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)以及1000u/mL粒細胞生長因子的(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)。培養(yǎng)5天后加入1μg/mL脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)誘導DC成熟。繼續(xù)培養(yǎng)7天后備用。
　　2.流式細胞術:ITP患者與正常人D

29、C分別用FITC-或者PE-結(jié)合的CD80，CD86，以及CD205抗體標記，同時標記同型對照。應用FACScalibur flow cytometer (BD Biosciences)上機檢測并應用Cell Quest Pro software (BD Biosciences)分析數(shù)據(jù)。
　　3.實時定量聚合酶鏈反應:分別收集ITP患者與正常人誘導的DC，提取總RNA用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA;用TOYOBO試劑盒，

30、羅氏480PCR儀器，定量擴增目的基因。
　　4.地塞米松干預試驗:誘導正常人成熟DC與未成熟DC，加入不同濃度地塞米松(0nmol/L，10nmol/L，25nmol/L，50nmol/L，100nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)3天。實時定量聚合酶鏈反應檢測CD205、CD80、CD83、CD86的相對表達量，分析CD205、CD80、CD83、CD86與糖皮質(zhì)激素治療的相關性。
　　5.免疫熒光組織化學實驗:取ITP患者與正常人脾

31、臟組織，包埋、冰凍、切片-20℃保存?zhèn)溆?。取組織切片，風干后丙酮固定，用含1％胎牛蛋白(bovine serum albumin，BSA)的磷酸鹽緩沖液（hosphate-buffered saline，PBS）水化，一抗染色過夜，PBS緩沖液洗3次后熒光二抗染色1小時。用Molecular Devices Olympus AX70顯微鏡觀測結(jié)果，并用METAMORPH Meta圖像分析軟件獲取組織圖像。
　　研究結(jié)果:
　

32、　1.正常人與ITP患者樹突狀細胞細胞CD205、CD80、CD83、CD86表達的情況:
　　1.1、在正常人中，隨著樹突狀細胞的趨于成熟，CD205、CD80、CD83、CD86的表達明顯增高。
　　1.2、ITP患者未成熟樹突狀細胞CD205表達較正常人明顯減少并且隨著DC的趨于成熟，CD205的表達量沒有顯著增加。ITP患者未成熟樹突狀細胞CD80、CD83、CD86較正常人明顯增高，并且伴隨著樹突狀細胞的成熟CD8

33、0、CD83、CD86的表達量較正常人明顯升高。
　　2.HD-dexa治療前后ITP患者DC細胞CD205、CD80、CD83、CD86表達的情況變化:HD-dexa治療后的患者成熟樹突狀細胞CD205表達量明顯升高，未成熟樹突狀細胞CD205表達量沒有明顯的變化。與此相似，成熟及不成熟樹突狀細胞CD80、CD86的表達量明顯降低。雖然未成熟樹突狀細胞CD83的表達量在HD-dexa治療后顯著降低，但成熟樹突狀細胞CD83的表達

34、量無明顯變化。
　　3.HD-dexa對DC表達CD205的影響:mDC的CD205表達量隨著地塞米松的濃度遞增，imDC的CD205表達量無明顯變化。CD80、CD83、CD86的表達與地塞米松的濃度無明顯相關性。
　　4.脾臟免疫組織熒光化學結(jié)果:
　　4.1、HE染色結(jié)果顯示:ITP患者脾臟淋巴小結(jié)數(shù)量較正常人明顯增多，淋巴小結(jié)中B細胞區(qū)和T細胞區(qū)明顯增大。
　　4.2、正常人脾臟DC細胞表型呈現(xiàn)CD205

35、+CD80-CD86-HLA-DR+狀態(tài)，分布于紅髓與白髓交界的淋巴小結(jié)周圍帶。ITP患者脾臟DC細胞表型呈現(xiàn)CD205low/-CD80+CD86+HLA-DR+狀態(tài)，聚集在T細胞區(qū)以及B細胞區(qū)。
　　結(jié)論:
　　1.ITP患者DC細胞CD205表達量較正常人明顯減低。并且ITP患者DC細胞趨于成熟狀態(tài)。
　　2.HD-dexa治療后的患者CD205表達量明顯增加并且DC的成熟度明顯降低
　　3.地塞米松與mD