荔枝果實成熟過程中的差異蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、本研究以荔枝品種‘烏葉’(Litchi chinensis Sonn.cv.‘Wuye’)和‘下番枝’(Litchi chinensis Sonn.cv.‘Xiafanzhi’)果實為試驗材料，利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)對荔枝果實不同成熟時期進行了差異蛋白質(zhì)組學研究。獲得了與荔枝果實成熟衰老相關(guān)的差異蛋白，并對部分差異蛋白進行cDNA克隆及相對定量表達分析。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.建立了適合荔枝果皮和假種皮中總蛋白質(zhì)提取的方法

2、和雙向電泳體系。以荔枝果皮和假種皮為材料，比較了TCA-丙酮、丙酮和酚3種提取方法在總蛋白產(chǎn)量、單向SDS-PAGE和雙向電泳等方面的區(qū)別，并對荔枝果皮和假種皮的雙向電泳體系進行探索。結(jié)果表明，酚抽提法最佳，提取的總蛋白得率最高；所獲蛋白在單向SDS-PAGE中形成條帶數(shù)目最多，最清晰；經(jīng)雙向電泳分離用銀染顯色，2D圖譜分辨率較好，蛋白點清晰，主要分布在pH4-8，15.0-85.0 kD，可有效解析荔枝果皮和假種皮的蛋白質(zhì)組。

3、　　 2.采用18 cm pH4-7和pH3-10 IPG膠條相結(jié)合的方法對‘烏葉’果皮不同成熟期進行蛋白質(zhì)分離，隨著果皮的成熟蛋白點數(shù)總體表現(xiàn)出先上升后下降的變化。其中，以階段Ⅲ檢測到的蛋白點數(shù)目最多，分別為753和937個，這個時期剛好處在荔枝果皮的轉(zhuǎn)色期；以階段Ⅵ完全轉(zhuǎn)紅期的蛋白點數(shù)最少，分別為651和604個。從pH4-7膠條分離的蛋白中選取79個和pH3-10膠條分離的蛋白中選取28個，總107個差異蛋白進行MALDI-TO

4、F/TOF質(zhì)譜分析，獲得了107個完整的肽指紋圖譜，61個差異蛋白獲得成功鑒定，成功率約為57.0％。通過生物信息學分析，這些鑒定成功的已知蛋白參與了糖和能量代謝(29.51％)、蛋白質(zhì)合成和代謝以及穩(wěn)定(11.48％)、基因表達調(diào)控(11.48％)、抗氧化(9.84％)、細胞代謝和周期調(diào)控(4.92％)、氨基酸代謝(4.92％)、轉(zhuǎn)錄與翻譯(4.92％)、信號轉(zhuǎn)導(1.64％)等生命活動功能，功能未知的蛋白為21.31％。
　　

5、 3.采用18 cm pH4-7和pH3-10 IPG膠條相結(jié)合的方法對‘下番枝’果皮不同轉(zhuǎn)色期進行蛋白質(zhì)分離，隨著果皮轉(zhuǎn)色的進程蛋白點數(shù)表現(xiàn)出上升趨勢。其中，以果皮轉(zhuǎn)紅階段檢測到的蛋白點數(shù)目最多，分別為750和1106個，在果皮為青色期的蛋白點最少，分別為643和1041個。從pH4-7膠條分離的蛋白中選取55個和pH3-10膠條分離的蛋白中選取10個，總65個差異蛋白進行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析，獲得了65個完整的肽指紋

6、圖譜，43個差異蛋白獲得成功鑒定，成功率約為66.15％。通過生物信息學分析，這些鑒定成功的蛋白參與了糖和能量代謝(20.93％)、蛋白質(zhì)合成和代謝以及穩(wěn)定(16.28％)、基因表達調(diào)控(13.95％)、信號轉(zhuǎn)導(6.98％)、氨基酸代謝(6.98％)、轉(zhuǎn)錄與翻譯(6.98％)、次生代謝(4.65％)、抗氧化(4.65％)、細胞結(jié)構(gòu)相關(guān)(2.33％)、激素相關(guān)(2.33％)等生命活動功能，功能未知的蛋白為13.95％。
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7、.采用18 cm pH4-7膠條對‘烏葉’假種皮不同成熟期進行蛋白質(zhì)分離，隨著果皮轉(zhuǎn)色的進程蛋白點數(shù)表現(xiàn)出先上升再下降的變化趨勢。其中，以階段Ⅲ檢測到的蛋白點數(shù)目最多1374個，這個時期剛好處在荔枝果實的轉(zhuǎn)色期；以階段Ⅵ果實完全轉(zhuǎn)紅期的蛋白點數(shù)最少914個；其它時期檢測到的蛋白點為：階段Ⅰ1144個、階段Ⅱ1330個、階段Ⅳ1096個、階段Ⅴ1012個。這與烏葉果皮轉(zhuǎn)色過程中蛋白質(zhì)點數(shù)的總體變化趨勢相似，在階段Ⅲ能檢測到的蛋白質(zhì)最多，在

8、階段Ⅵ完全轉(zhuǎn)紅期的蛋白質(zhì)最少。選取64個差異蛋白進行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析，獲得了64個完整的肽指紋圖譜，43個差異蛋白獲得成功鑒定，成功率約為67.19％。通過生物信息學分析，這些鑒定成功的蛋白參與了糖和能量代謝(27.91％)、蛋白質(zhì)合成和代謝以及穩(wěn)定(11.63％)、氨基酸代謝(6.98％)、細胞結(jié)構(gòu)和周期調(diào)控(6.98％)、基因表達調(diào)控(4.65％)、轉(zhuǎn)錄與翻譯(9.3％)、信號轉(zhuǎn)導(4.65％)、抗氧化(4.65％

9、)、次生代謝(4.65％)等生命活動功能，功能未知的蛋白為18.6％。
　　 5.荔枝果實成熟過程中部分相關(guān)蛋白的基因克隆及其在果皮中的表達。
　　 ①克隆了荔枝果皮Actin1基因的cDNA序列，該序列全長1418 bp，其中開放閱讀框(ORF)共有1134 bp，編碼377個氨基酸。Actin1在荔枝果皮不同成熟期的蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的表達相對穩(wěn)定，變化不大。因此，在研究熒光定量表達分析中，所克隆的Actin1基因可

10、作為其它目的基因的內(nèi)參基因。
　　 ②克隆了荔枝果皮UFGT基因的cDNA序列，該序列全長1577 bp，其中開放閱讀框(ORF)共有1362 bp，編碼453個氨基酸。荔枝果皮UFGT基因在轉(zhuǎn)錄水平隨著果皮著色的加深呈不斷上升變化，與其在果皮成熟過程中的蛋白水平表達趨勢一致。
　　 ③克隆了荔枝果皮OEE1基因的cDNA序列，該序列全長1217 bp，其中開放閱讀框(ORF)共有1002 bp，編碼333個氨基酸。荔枝

11、果皮OEE1基因在轉(zhuǎn)錄水平隨著果皮著色的加深呈不斷下降變化，與其在果皮成熟過程中的蛋白水平表達趨勢一致。
　　 ④克隆了荔枝果皮rbcs基因的cDNA序列，該序列全長868 bp，其中開放閱讀框(ORF)共有567 bp，編碼188個氨基酸。荔枝果皮rbcs基因在轉(zhuǎn)錄水平隨著果皮著色的加深呈不斷下降變化，與其在果皮成熟過程中的蛋白水平表達趨勢一致。
　　 ⑤克隆了荔枝果皮Aconitase基因的cDNA序列，該片段序列長

12、2945 bp，編碼883個氨基酸。荔枝果皮Aconitase基因在轉(zhuǎn)錄水平隨著果皮著色的加深呈不斷上升變化，與其在果皮成熟過程中的蛋白水平表達趨勢一致。
　　 ⑥克隆了荔枝果皮ASR基因的cDNA序列，該片段序列長515 bp，編碼99個氨基酸。荔枝果皮ASR基因在轉(zhuǎn)錄水平隨著果皮著色的加深呈先上升后下降的變化，在階段Ⅱ的表達量最高，與其在果皮成熟過程中的蛋白水平表達趨勢一致。
　　 ⑦克隆了荔枝果皮TCTP基因的cD

13、NA序列，該序列全長848bp，其中開放閱讀框(ORF)共有507 bp，編碼168個氨基酸。荔枝果皮TCTP基因在轉(zhuǎn)錄水平隨著果皮著色的加深呈先上升后下降再上升的變化，與其在果皮成熟過程中的蛋白水平表達趨勢不太一致。
　　 ⑧克隆了荔枝果皮14-3-3基因的cDNA序列，該序列全長1084 bp，其中開放閱讀框(ORF)共有792 bp，編碼261個氨基酸。荔枝果皮14-3-3基因在轉(zhuǎn)錄水平隨著果皮著色的加深呈先上升后下降再上