青藤堿對人外周血CD4+T細胞ERK1-2及TNF-α表達的體外研究.pdf

1、目的:通過人外周血CD4+T淋巴細胞增殖模型的體外實驗,檢測鹽酸青藤堿(Alkaloid Sinomeuine SIN)對人外周血CD4+T淋巴細胞磷酸化的ERK1/2蛋白表達及TNF-α表達的體外影響,研究SIN對人外周血CD4+T淋巴細胞免疫抑制作用及效應,進一步探討SIN對人T淋巴細胞免疫抑制作用的細胞學及分子生物學機制,為臨床應用SIN進行器官移植免疫治療提供理論依據(jù)。
　　方法:在衡陽市中心血站抽取3個健康人肘靜脈血50

2、ml,肝素(10U/ml)抗凝。用淋巴細胞分離液從血液標本中分離PBMC,并制成PBMC懸液。通過免疫磁珠分離法從PBMC懸液中分選CD4+T細胞。將CD4+T細胞用10％FCS RPMI-1640完全培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。CD4+T細胞經(jīng)終濃度為5μg/ml的PHA和終濃度為100U/ml的IL-2擴增7天后,將擴增后的細胞用PBS洗3遍,繼續(xù)培養(yǎng)(細胞培養(yǎng)液中不含rIL-2和PHA)1天,細胞接種于中方瓶,生長至70

3、%-80%時(對數(shù)生長期),各組細胞培養(yǎng)液中加入終濃度1μg/ml的鼠抗人CD3單克隆抗體,繼續(xù)培養(yǎng)6小時后,細胞的處理分二部分:1、Western blot法檢測相同濃度不同作用時間的SIN對人外周血CD4+T細胞p-ERK1/2蛋白表達水平:1)0min組:細胞培養(yǎng)液中加入不含任何藥物的與實驗組等量的SIN稀釋液;2)細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為200μmol/L的SIN溶液,分別作用15min,30min,1h,1.5h,2h;2、E

4、LLSA法檢測TNF-α表達水平:1)空白對照組:細胞培養(yǎng)液中加入不含任何藥物的與實驗組等量的SIN稀釋液;2)CsA組:細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為50ng/ml的CsA溶液;3)低濃度SIN組:細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為10μmol/L的SIN溶液;4)中濃度SIN組:細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為200μmol/L的SIN溶液;5)高濃度SIN組:細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為1000μmol/L的SIN溶液。
　　結果:1、Western

5、blot法檢測相同濃度(200μmol/L)不同作用時間的SIN p-ERK1/2的表達水平(灰度值):1)0min組:3.15±0.36;2)15min組3.12±0.19;3)30min組:2.50±0.36;4)1h組:2.07±0.21;5)1.5h組:1.35±0.65;6)2h組:0.93±0.13。從結果可以看出:0min組與15min組比較無顯著性差異(P>0.05),其余各組與空白對照組比較均有顯著性差異(P<0.05

6、),2h組灰度值最低,與各組比較均有顯著差異(P<0.05)。SIN能降低人外周血CD4+T細胞p-ERK1/2的蛋白表達,與SIN作用時間存在時間依賴性關系。2、ELLSA法檢測TNF-α表達水平:1)對照組:680.29±153.27;2)CsA組:209.46±65.33;3)低濃度SIN組:612.94±128.64;4)中濃度SIN組:451.06±70.29;5)高濃度SIN組:261.98±29.33。從結果可以看出:低濃

7、度CsA組與對照組無顯著差異外(P>0.05),其它各組組間TNF-α表達水平均數(shù)兩兩比較均有顯著性差異(p<0.05)。SIN能濃度依賴性地降低人外周血CD4+T細胞TNF-α的表達。
　　結語:SIN能濃度依賴性地降低人外周血CD4+T細胞TNF-α的表達,相同濃度的SIN與人外周血CD4+T細胞p-ERK1/2蛋白表達有時間依賴性,SIN對人外周血CD4+T細胞免疫抑制作用的分子生物學機制可能與其抑制p-ERK1/2及TNF