散發(fā)性結(jié)直腸癌高頻雜合缺失及轉(zhuǎn)移相關(guān)區(qū)域基因精細(xì)定位及初步篩選.pdf

1、散發(fā)性結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來在我國的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，嚴(yán)重威脅人民的健康。為了實現(xiàn)腫瘤的早期診斷和治療，必須明確腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機制。腫瘤抑制基因的失活是導(dǎo)致腫瘤形成和發(fā)展的一個主要因素，最常見的失活形式即等位基因的雜合性缺失(LOH)。通常在染色體上的高頻雜合區(qū)域含有一個或多個腫瘤抑制基因。通過尋找等位基因雜合缺失的高發(fā)區(qū)域，即可能找到腫瘤相關(guān)基因。在散發(fā)性結(jié)直腸癌利用多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記對腫瘤細(xì)胞進行基因掃描，尋找等

2、位基因雜合缺失的高發(fā)區(qū)域，將腫瘤相關(guān)基因定位于染色體某一狹窄區(qū)域，并通過對該區(qū)域中分布的基因進行檢測篩選，進而明確其中存在的腫瘤相關(guān)基因。這是當(dāng)前在全基因組范圍系統(tǒng)尋找腫瘤相關(guān)基因的主要策略之一。利用上述定位候選克隆的策略，本研究對散發(fā)性結(jié)直腸癌染色體3、16p、16q、17p進行雜合性缺失分析，將發(fā)現(xiàn)的高頻雜合缺失區(qū)域利用更高密度的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記進行精細(xì)定位分析，尋找同源缺失的最小片段，將腫瘤相關(guān)基因精細(xì)定位至平均1—2cM范圍。同

3、時，對2號和16號染色體上發(fā)現(xiàn)的兩個散發(fā)性結(jié)直腸癌分化及轉(zhuǎn)移相關(guān)區(qū)域進行精細(xì)定位研究。本研究力圖將腫瘤相關(guān)基因的候選區(qū)域定位至盡可能小的范圍，并初步篩查候選基因，為進一步的基因篩選和克隆奠定基礎(chǔ)。 方法：分別用覆蓋染色體3、16p、16q、17p的13、5、5、5對多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記(平均遺傳距離約10cM)對83例散發(fā)性結(jié)直腸癌腫瘤和對應(yīng)正常組織進行“touch-down"PCR反應(yīng)，擴增相應(yīng)位點的基因組DNA。PCR產(chǎn)物在AB

4、IPrism377自動測序儀進行電泳，用Genescan3．7和Genotype3．7軟件進行基因分型和雜合缺失分析。初步定位高頻雜合缺失區(qū)域后，用覆蓋這些區(qū)域的高密度的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記(平均遺傳距離約0．7cM)對其進行精細(xì)定位。另對2號和16號染色體上發(fā)現(xiàn)的兩個腫瘤分化和轉(zhuǎn)移相關(guān)區(qū)域用上述方法進行精細(xì)定位研究。 結(jié)果：在16號染色體短臂(16p)發(fā)現(xiàn)了一個高頻雜合缺失位點D16S404，對其所在區(qū)域用5對微衛(wèi)星標(biāo)記精細(xì)定位，

5、確定最小雜合缺失區(qū)域位于D16S406一D16S3126間，遺傳距離約1．1cM。在16號染色體長臂(16q)發(fā)現(xiàn)了一個高頻雜合缺失位點D16S503，對其所在區(qū)域用8對微衛(wèi)星標(biāo)記精細(xì)定位，確定了兩個精細(xì)高頻雜合缺失區(qū)間：一個位于D16S3143一D16S3050間，遺傳距離約2cM：另一個位于D16S3094-D16S3143間，遺傳距離約1．6cM。在3號染色體發(fā)現(xiàn)了一個高頻雜合缺失位點D3S1300，對其用5對微衛(wèi)星標(biāo)記精細(xì)定位，

6、確定最小雜合缺失區(qū)間位于D3S1547一D3S1312間，遺傳距離約1．9cM。在17號染色體短臂發(fā)現(xiàn)4個高頻雜合缺失位點，其中D17S1857離TP53最遠(yuǎn)，對其用10對微衛(wèi)星標(biāo)記精細(xì)定位，發(fā)現(xiàn)其整段呈高頻雜合缺失狀態(tài)。而雜合缺失率最高的連續(xù)雜合缺失區(qū)間為17p11．2區(qū)域包含D17S2196、D17S953及D17S1871三個位點的4Mb區(qū)間。用8對微衛(wèi)星標(biāo)記對2號染色體腫瘤分化相關(guān)位點D2S142所在區(qū)域進行精細(xì)定位，確定了D2

7、S142一D2S284間約3．8cM和D2S2275一D2S2299間約3．2cM的兩個腫瘤相關(guān)基因候選區(qū)間。用7對微衛(wèi)星標(biāo)記對16號染色體長臂腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)位點D16S520所在區(qū)域進行精細(xì)定位，確定了D16S498一D16S3123間約1．3cM和D16S402一D16S3061間約2cM的腫瘤相關(guān)基因候選區(qū)間。檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫，初步篩選出3號染色體FHIT、PTPRG；16號染色體短臂USP7；16號染色體長臂CDHll、CDH8；1

8、7號染色體17p11．2區(qū)域FLCN、COPS3、PMP22等基因很可能是上述染色體上的散發(fā)性結(jié)直腸癌腫瘤相關(guān)基因。而腫瘤分化相關(guān)區(qū)域內(nèi)NR4A2、GALNT5、ACVRlC、ACVRl、LOC344332、NMI、RIFl和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)區(qū)域內(nèi)CDHl3、MBTPSl、OKL38、HSDl782等基因可能為各自候選區(qū)間內(nèi)的散發(fā)性結(jié)直腸癌腫瘤相關(guān)基因。另外，D16S498一D16S3123的1．3cM區(qū)間內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的已知基因。

9、 結(jié)論：(1)本研究證實一些公認(rèn)的腫瘤抑制基因很可能參與了散發(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。而候選區(qū)間內(nèi)部分候選腫瘤相關(guān)基因此前未被證實與結(jié)直腸癌有關(guān)，對它們在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和突變等進行檢測，可能篩選出新的結(jié)直腸癌腫瘤相關(guān)基因。(2)16q24．2區(qū)域D16S498一D16S3123約1．3cM的候選區(qū)間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的已知基因，對這一區(qū)間的進一步研究可能會克隆新的腫瘤相關(guān)基因。(3)證明定位候選克隆策略在散發(fā)性結(jié)直腸癌的研究中是高