低切應(yīng)力對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能的調(diào)控及SL提取物的干預(yù)機(jī)制.pdf

1、研究背景及目的:
　　 隨著社會(huì)的發(fā)展，心血管類疾病已成為威脅人類生命健康和生活質(zhì)量的頭號(hào)疾病。心血管疾病共同的病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)。對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的研究一直是醫(yī)藥學(xué)界研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，到目前為止，對(duì)于As的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但As發(fā)生的始動(dòng)因素得到了國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的普遍共識(shí)，即血管內(nèi)皮損傷。血管內(nèi)皮損傷直接導(dǎo)致內(nèi)皮屏障功能障礙，血管內(nèi)皮通透性增高，致病因子侵入內(nèi)皮，誘導(dǎo)As發(fā)生

2、和發(fā)展。在導(dǎo)致血管內(nèi)皮屏障功能障礙的因素中，血流切應(yīng)力具有至關(guān)重要的作用。
　　 血流切應(yīng)力已被證明在As斑塊發(fā)生的局灶性中具有重要作用。在低切應(yīng)力(＜4 dyn· cm-2)血流作用下的動(dòng)脈血管更易于形成斑塊，而高切應(yīng)力(＞15dyn· cm-2)對(duì)血管具有保護(hù)的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞直接感受血流切應(yīng)力的變化，低切應(yīng)力作用可以引起細(xì)胞骨架重構(gòu)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮屏障功能的損害，使血液中的脂質(zhì)等物質(zhì)更易通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)As的形成。

3、>　　 F-actin(微絲肌動(dòng)蛋白)是調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)的主要收縮蛋白。F-actin重排依賴于肌球蛋白輕鏈(Myosin Light Chain，MLC)的磷酸化。肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin Light Chain Kinase,MLCK)和ROCK/ROK/Rho激酶(Rho Kinase,ROCK)是調(diào)節(jié)MLC磷酸化的兩種重要激酶。研究證實(shí)，血流切應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞的收縮具有Ca2+依賴性（MLCK通路）和非Ca2+依賴性（RO

4、CK通路）兩種途徑。那么血流切應(yīng)力對(duì)臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞骨架重排的作用是否也具有Ca2+依賴性和非Ca2+依賴性還需要研究證實(shí)。參蓮提取物(SL extract)是在中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)較為公認(rèn)的As病理機(jī)制的“損傷—反應(yīng)學(xué)說(shuō)”和現(xiàn)代藥理學(xué)研究成果所精選出的防治As有效組方的提取物。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果證實(shí)，SL提取物能改善血管內(nèi)皮功能，對(duì)As有很好的防治作用，但其改善內(nèi)皮功能是否通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞骨架的改變或重組而起作用未見(jiàn)相

5、關(guān)報(bào)道。
　　 因此，本課題以研究參蓮提取物抑制細(xì)胞骨架重構(gòu)為目的，從誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)的關(guān)鍵蛋白——肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化為切入點(diǎn)，重點(diǎn)研究SL提取物對(duì)介導(dǎo)MLC磷酸化的兩條關(guān)鍵通路:肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)通路和ROCK激酶信號(hào)通路的干預(yù)作用，從血流切應(yīng)力角度分析SL提取物抑制細(xì)胞骨架重構(gòu)的Ca2+依賴性和非Ca2+依賴性效應(yīng)，探討SL提取物抑制As發(fā)生的作用機(jī)制。
　　 研究方法和內(nèi)容:
　　 1

6、.SL提取物對(duì)低切應(yīng)力介導(dǎo)的兔頸總動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用研究
　　 首先應(yīng)用頸總動(dòng)脈套管法建立局部低切應(yīng)力兔動(dòng)脈粥樣硬化模型。在模型建立的2周、4周和8周，運(yùn)用電磁血流量計(jì)分別檢測(cè)套管近心端和對(duì)側(cè)的血流量，耳中動(dòng)脈取血后，應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組動(dòng)物的全血粘度和血清總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇(Low Density Lipopro

7、tein Cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HighDensity Lipoprotein Cholesterol，HDL-C)的水平;同時(shí)在2周、4周和8周時(shí)取血管近心端及對(duì)側(cè)相同體位血管，固定后HE染色觀察血管病理情況，掃描電鏡觀察內(nèi)皮形態(tài)變化。
　　 2.SL提取物對(duì)低切應(yīng)力誘導(dǎo)的兔頸總動(dòng)脈粥樣硬化形成的機(jī)制研究
　　 在造模并給藥的2周、4周和8周，取頸總動(dòng)脈套管處的近心端及對(duì)側(cè)相同體位的

8、血管，裂解組織后提取蛋白，應(yīng)用Western blot檢測(cè)血管組織中肌球蛋白輕鏈(MLC)和MLC的磷酸化水平p-MLC，檢測(cè)肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和ROCK/ROK/Rho激酶(ROCK)的表達(dá);免疫組織化學(xué)法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)MLCK蛋白和ROCK蛋白表達(dá)水平。
　　 3.SL提取物干預(yù)切應(yīng)力介導(dǎo)的人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞鈣內(nèi)流的研究
　　 Bioflux1000控剪應(yīng)力微流通道培養(yǎng)人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞;數(shù)控剪切流系統(tǒng)加載不同

9、切應(yīng)力后進(jìn)行免疫熒光染色，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞內(nèi)游離鈣變化。在應(yīng)用MLCK特異性阻斷劑ML-7，ROCK特異性阻斷劑Y-27632及鈣通道阻斷劑Nicardipine干預(yù)的前提下，加載不同切應(yīng)力，觀察SL提取物對(duì)低切應(yīng)力依賴的鈣內(nèi)流的影響。
　　 4.SL提取物對(duì)切應(yīng)力介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重排的作用機(jī)制研究
　　 BioFlux1000高通量微流系統(tǒng)培養(yǎng)人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，加載切應(yīng)力后，進(jìn)行免疫熒光染色，應(yīng)用激光共聚

10、焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架的變化，分析F-actin、MLCK、ROCK、MLC、p-MLC表達(dá)的變化。在應(yīng)用MLCK特異性阻斷劑ML-7、ROCK特異性阻斷劑Y-27632、鈣通道阻斷劑Nicardipine干預(yù)后，觀察SL提取物對(duì)切應(yīng)力介導(dǎo)的F-actin、MLCK、ROCK、MLC、p-MLC表達(dá)變化的影響，分析SL提取物的作用機(jī)制。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.低切應(yīng)力誘導(dǎo)的頸總動(dòng)脈粥樣硬化兔模型復(fù)制成功:套管近心端形

11、成局部低切應(yīng)力，對(duì)側(cè)為正常切應(yīng)力。SL提取物對(duì)局部血流具有一定的改善作用，能劑量依賴性的增高血管近心端血流量，明顯改善血流切應(yīng)力;SL提取物能降低As模型兔血脂水平，抑制內(nèi)膜增厚和斑塊的形成;掃描電鏡觀察結(jié)果顯示SL提取物對(duì)低切應(yīng)力誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷具有抑制作用。
　　 2.SL提取物能時(shí)間依賴性的抑制MLCK和ROCK在近心端的表達(dá)，對(duì)MLC的磷酸化水平也具有明顯的抑制作用。MLCK在血管的分布變化隨時(shí)間的進(jìn)展具有進(jìn)行性增高的

12、趨勢(shì)，前期主要在內(nèi)膜表達(dá)，4周和8周時(shí)在中膜和外膜表達(dá)較多;ROCK的表達(dá)分布主要集中在中膜。
　　 3.低切應(yīng)力可以有效介導(dǎo)HUAEC細(xì)胞胞漿游離鈣的增高，其作用具有時(shí)間依賴性;HUAEC胞內(nèi)游離鈣的增高作用主要與細(xì)胞外鈣的流入有關(guān);SL提取物可以抑制低切應(yīng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞外鈣內(nèi)流。
　　 4.低切應(yīng)力誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)的作用與MLC磷酸化水平有關(guān);在低切應(yīng)力作用下，F(xiàn)-actin、MLCK、ROCK、p-MLC/MLC表達(dá)