牛多殺性巴氏桿菌比較基因組學(xué)分析及保護(hù)性抗原的篩選.pdf

1、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是一種能夠引起禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、牛出血性敗血癥、牛肺炎等疫病的人畜共患性致病菌。根據(jù)菌體莢膜抗原的不同，可將其分為A、B、D、E和F5種莢膜血清型。以往在牛群中流行的主要是引起出血性敗血癥的莢膜血清B型，而近年來也分離到引起呼吸系統(tǒng)綜合癥為主的莢膜血清A型，該病已成為世界各地危害養(yǎng)牛業(yè)的主要疫病，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于Pm的血清型比較多，異源或異型Pm交叉

2、保護(hù)作用較低，給該病的防治帶來了較大困難。目前，國內(nèi)所用疫苗主要是針對牛出血性敗血癥的莢膜血清B型的傳統(tǒng)滅活疫苗，尚無針對A型的疫苗。因此，開展牛源Pm A型保護(hù)性抗原的篩選鑒定，對新型疫苗（尤其是對不同血清型具有交叉保護(hù)作用的疫苗）的研發(fā)具有重要的理論意義和實(shí)際意義。
　　本課題組先后從發(fā)病肉牛群中分離鑒定到6株A型Pm（PmCQ1~PmCQ6）和1株F型Pm（PmF），其中PmCQ1~PmCQ5為強(qiáng)毒株，PmCQ6為弱毒株。本

3、研究利用第二代測序技術(shù)對PmCQ6和B型標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)mB菌株（CVCC450）進(jìn)行全基因組測序，并結(jié)合之前實(shí)驗(yàn)室測序的PmCQ2和PmF以及NCBI上公布的多個(gè)Pm全基因組序列，通過比較基因組學(xué)分析，揭示了不同菌株基因組結(jié)構(gòu)及功能基因的差異，為新毒力基因的挖掘及致病機(jī)制的研究提供分子基礎(chǔ)。然后通過生物信息學(xué)和免疫蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選出Pm保護(hù)性抗原候選編碼基因，經(jīng)克隆表達(dá)及間接ELISA或蛋白免疫印跡分析候選抗原分子的反應(yīng)原性，最后，經(jīng)動(dòng)物

4、攻毒保護(hù)性試驗(yàn)評價(jià)候選分子的免疫保護(hù)效力，并篩選到多個(gè)保護(hù)性抗原，該研究為新型疫苗的研發(fā)提供了候選分子。本課題主要研究內(nèi)容如下：
　　1.多殺性巴氏桿菌全基因組測序與組裝
　　本研究將實(shí)驗(yàn)室保存的不同血清型Pm菌株（PmB、PmCQ2、PmCQ6和PmF）經(jīng)體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，4株P(guān)m菌落大小存在明顯的差異，尤其A型PmCQ6菌株明顯小于PmB、PmCQ2和PmF菌株。通過小鼠和家兔致病性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4株菌株的致病性存在明顯的差異，

5、B型PmB為強(qiáng)毒株，而A型PmCQ6為弱毒株。通過對雛雞的致病性發(fā)現(xiàn)，4株P(guān)m均不能引起雛雞的死亡。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期已完成了牛源A型PmCQ2（強(qiáng)毒株）和牛源F型PmF（弱毒株）的全基因組測序，為了更全面地分析牛源Pm的毒力基因差異和篩選交叉保護(hù)性抗原，我們使用第二代測序方法技術(shù)將獲得的牛源A型PmCQ6（弱毒株）和牛源B型PmB（強(qiáng)毒株）進(jìn)行全基因組測序，利用SOAPdenovo完成拼接組裝，并重新注釋4株P(guān)m基因組。通過4株

6、Pm基因組比較得出，4株P(guān)m基因組大小在2.2~2.3Mbp，預(yù)測ORF平均個(gè)數(shù)1977個(gè)，其GC含量約為39.1~40.39％，tRNA個(gè)數(shù)在43~50之間，均包含有16S-23S-5S rRNA元件。通過基因組信息圖的繪制、基因組的功能注釋和噬菌體相關(guān)基因的預(yù)測，我們得知4株P(guān)m基因組均存在一定的差異。
　　2.多殺性巴氏桿菌比較基因組學(xué)分析
　　本研究將測序的4株菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布的24株P(guān)m菌株根據(jù)core

7、 genes構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)PmCQ2、PmCQ6和36950聚為一枝，PmB與2213聚為一枝，PmF與Pm70聚為一枝，我們選擇不同宿主（牛、豬、羊、禽）和不同血清型（A、B、D和F型）的10株不同毒力的Pm進(jìn)行比較基因組學(xué)分析。通過全基因組共線性分析得知，Pm基因組共線性較好，基因組比較保守，但不同菌株會(huì)出現(xiàn)不同片段的插入。對插入序列的預(yù)測發(fā)現(xiàn)，PmCQ2、36950和HN06菌株中都有大片段的插入序列，而PmF株上未發(fā)現(xiàn)插入序列

8、，推測強(qiáng)毒株與弱毒株毒力大小的差異可能存在于大片段轉(zhuǎn)座子的插入與缺失。通過差異基因的分析預(yù)測，我們篩選到不同血清型和不同宿主源的差異基因，可以為種型診斷靶標(biāo)的篩選和宿主嗜性分析提供理論依據(jù)。通過基因組島、莢膜基因、脂多糖相關(guān)基因等毒力相關(guān)基因分析比較強(qiáng)弱毒株之間的差異，推測轉(zhuǎn)座酶、噬菌體整合相關(guān)基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因可能與強(qiáng)毒株與弱毒株或無毒株之間的毒力大小差異有關(guān)。通過與雙組分調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫P2CS數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)在PmB和PmF中

9、有18個(gè)雙組分調(diào)節(jié)元件，在PmCQ2和PmCQ6中有16個(gè)雙組分調(diào)節(jié)元件，分屬于7類雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)。最后，通過生物信息學(xué)分析篩選到4株共有的膜蛋白有458個(gè)，共有的分泌蛋白有162個(gè)，該結(jié)果為后續(xù)新型疫苗候選分子的篩選奠定基礎(chǔ)。
　　3.保護(hù)性抗原候選分子的篩選
　　結(jié)合上一部分篩選的4株測序菌株共有的膜蛋白和分泌蛋白，經(jīng)Signal和TMMHM在線網(wǎng)站對分析結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步預(yù)測，最后篩選到48個(gè)候選抗原基因。通過Triton

10、X-114方法提取4株P(guān)m的外膜蛋白，經(jīng)免疫蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選到15個(gè)候選抗原基因。將以上兩種方法篩選得到的候選抗原基因，經(jīng)克隆表達(dá)，最終表達(dá)得到42個(gè)候選分子，純化后使用實(shí)驗(yàn)室制備4種牛血清（PmCQ2人工感染血清、PmCQ2滅活苗免疫血清、PmB人工感染血清和PmF人工感染血清）經(jīng)間接ELISA對其反應(yīng)原性進(jìn)行分析，共篩選到27個(gè)具有較高反應(yīng)原性的候選分子。其中篩選到與4種血清反應(yīng)原性較高的有5個(gè)；與A、B、F型人工感染血清反應(yīng)原

11、性較高有1個(gè)；與A、B型人工感染血清反應(yīng)原性較高的有10個(gè)；僅與A型人工感染血清反應(yīng)原性較高的6個(gè)；僅與B型人工感染制備的血清反應(yīng)較高有5個(gè)。
　　為了確定攻毒的最佳途徑，我們首先將 PmCQ2培養(yǎng)物分別通過滴鼻、腹腔和肌肉接種途徑感染小鼠后，觀察其存活情況、體內(nèi)定植以及病理變化，結(jié)果顯示三種途徑下 PmCQ2均能夠定植于小鼠的肝、脾和肺等臟器中，且均能夠引起肺臟發(fā)生病理變化，導(dǎo)致小鼠死亡，該結(jié)果提示小鼠建模成功。但由于PmB通過

12、滴鼻方式不能引起小鼠死亡，因此我們選擇肌肉注射作為評價(jià)候選抗原分子保護(hù)性的最佳途徑。選擇反應(yīng)原性較高的10個(gè)重組候選分子進(jìn)行動(dòng)物攻毒保護(hù)性試驗(yàn)，分析其免疫保護(hù)效果。結(jié)果表明，經(jīng)rPmCQ2_1g0524和rPmCQ2_1g0311免疫后的小鼠均可以在一定程度上抵抗PmCQ2株的攻擊，其保護(hù)性為30%，對PmB和PmF無保護(hù)性；同時(shí)發(fā)現(xiàn)對 PmCQ2、PmB具有交叉保護(hù)作用的為 rPmCQ2_1g0376和rPmCQ2_1g0327，其保

13、護(hù)性分別為50%/30%和50%/40%；對PmCQ2，PmB和PmF具有交叉保護(hù)性作用的有 rPmCQ2_4g0132和 rPmCQ2_2g0128，其保護(hù)性分別為80%/20%/10%和50%/40%/30%；僅對PmB和PmF具有一定的保護(hù)性的抗原為rPmCQ2_2g0128，其PmB和PmF保護(hù)性是40%和30%。該研究首次篩選到牛源A型菌株中具有交叉保護(hù)作用的候選分子。
　　4. PmCQ2_1g0327交叉保護(hù)性研究<

14、br>　　基于生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PmCQ2_1g0327僅存在于A型Pm中，而PmCQ2_1g0376、PmCQ2_4g0132和PmCQ2_2g0128則在A、B、D和F型Pm中均存在。通過Pm全基因組序列的同源性分析和體外培養(yǎng)菌株的熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，該基因僅存在于A型菌株，在弱毒株P(guān)mCQ6菌株中表達(dá)較低，且不存在于PmB和PmF中。通過DNAstar軟件和IEDB等線分析預(yù)測PmCQ2_1g0327存在的潛在的優(yōu)勢抗原表位序列

15、，而且這些抗原表位多集中于該序列的N端。為了驗(yàn)證其潛在的優(yōu)勢抗原表位，將PmCQ2_1g0327全長基因分別截取7個(gè)片段進(jìn)行克隆表達(dá)純化，并通過間接 ELISA分析反應(yīng)原性，結(jié)果顯示包含 TIDTAPKQNPVPT抗原表位的216-306bp與 PmCQ2、PmB人工感染的血清反應(yīng)原性較高。經(jīng)動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該肽段對PmCQ2和PmB的保護(hù)性分別是40%和10%，值得注意的是274-695bp的肽段對PmB具有一定的保護(hù)性，推斷

16、該抗原表位能夠在保護(hù)宿主抵抗PmB的攻擊中發(fā)揮主要作用。將rPmCQ2_1g0327蛋白序列和優(yōu)勢抗原表位序列與PmB全基因組序列進(jìn)行Blast分析，發(fā)現(xiàn)該序列與PmB_1759g0022的同源性較高，將PmB_1759g0022克隆表達(dá)，免疫小鼠后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， rPmB_1759g0022對 PmB的保護(hù)性為40%。由此推測該TIDTAPKQNPVPT抗原肽段在抵抗 PmB侵襲中起到關(guān)鍵作用。最后，純化可溶蛋白rPmCQ2_1g

17、0327制備小鼠多克隆抗體，其抗體效價(jià)為1:102400。通過 WB結(jié)果可知， rPmB_1759g0022與rPmCQ2_1g0327的鼠多抗有較好的反應(yīng)原性。通過IFA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rPmCQ2_1g0327抗體能夠特異地識(shí)別PmCQ2細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上的抗原，并與之發(fā)生免疫反應(yīng)，提示該蛋白主要分布于PmCQ2的表面?？贵w封閉實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rPmCQ2_1g0327在細(xì)菌黏附方面作用并不顯著。
　　綜上所述，本研究我們結(jié)合生物信