牛源A型多殺性巴氏桿菌溶血特性分析及滅活疫苗候選菌株篩選.pdf

1、牛源A型多殺性巴氏桿菌是一種條件致病菌，主要引起牛肺炎，近年來在我國不斷流行，嚴(yán)重影響著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。目前我國尚無針對A型多殺性巴氏桿菌的疫苗，給多殺性巴氏桿菌的防控帶來了極大困難。有報道，多殺性巴氏桿菌在厭氧條件下出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，但對溶血性的相關(guān)分析還研究較少。
　　 1、多殺性巴氏桿菌溶血特性比較及溶血相關(guān)基因ahpA相關(guān)研究
　　 本試驗就6株牛源A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ1-6)在雞血，兔血和羊血平板上的溶血特性

2、進行比較，克隆并比對了6株菌的溶血相關(guān)基因ahpA，構(gòu)建遺傳進化樹，同時擴增和比對分析了其上游調(diào)控序列。對有氧和厭氧條件下培養(yǎng)的多殺性巴氏桿菌的ahpA基因表達量進行熒光定量分析。構(gòu)建PmCQ2菌株ahpA基因的原核表達載體(pET-32a-ahpA，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-21(DE3)，觀察該重組菌溶血現(xiàn)象，對ahpA蛋白進行免疫印跡分析和免疫保護性研究。結(jié)果顯示，PmCQ1能夠溶解雞血和兔血;PmCQ2、PmCQ4及PmCQ6能夠溶解3

3、種動物紅血球;PmCQ5僅能夠溶解兔血;而PmCQ3均不能溶解3種動物紅血球。PmCQ1-6 ahpA同源性達100％，且較為保守，上游調(diào)控序列也一致。ahpA基因在有氧條件下不表達，僅在厭氧條件下表達，且各株菌間表達量差異顯著。重組菌在厭氧條件下溶血，有氧培養(yǎng)不溶血。通過免疫印跡分析和攻毒保護試驗，證實ahpA蛋白是一種良好的免疫原。本研究結(jié)果初步表明，多殺性巴氏桿菌的溶血差異性與ahpA基因的表達量存在一定關(guān)聯(lián);ahpA蛋白具有良好

4、的免疫活性。
　　 2、A型多殺性巴氏桿菌滅活疫苗侯選菌株篩選
　　 通過Reed-Muench法計算6株多殺性巴氏桿菌PmCQ1-6對小鼠的LD50（毒力測定）。結(jié)果顯示PmCQ1-6對昆明鼠的LD50分別為3.18×105CFU，2.2×105CFU，6.54×105CFU，3.45×105CFU，3.0×105CFU和1.14×108CFU，以PmCQ2毒力最強，PmCQ6毒力明顯低于其他5株。通過交互免疫試驗對6

5、株菌進行免疫原性的分析，結(jié)果顯示，PmCQ1-6組交互試驗的保護率分別為88.57％，85.71％，77.14％，80％，60％和80％，以PmCQ1保護效果最好，PmCQ2次之，PmCQ5最差。將PmCQ2連續(xù)傳代，通過接種生化鑒定管，比較原代、第90代和第150代的生化遺傳穩(wěn)定性;通過小鼠攻毒試驗，比較原代、第90代和第150代的毒力遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明，PmCQ2的生化和毒力遺傳穩(wěn)定性均較好。綜上，PmCQ2可以作為滅活疫苗的候選

6、菌株。
　　 3、疫苗制備及成品檢驗
　　 經(jīng)過菌液培養(yǎng)、計數(shù)、滅活、油相制備、水相制備和配苗乳化等程序，獲得滅活疫苗250mL，含菌量為4×109CFU/mL。接種200μL滅活疫苗于馬丁肉湯平板培養(yǎng)，觀察有無雜菌生長，進行無菌檢驗;注射家兔疫苗5mL/只，觀察10天，進行安全檢驗;將疫苗分為0.5mL，1mL，1.5mL3個梯度免疫家兔，對照組免疫無菌PBS，21天后攻毒1MLD的A型多殺性巴氏桿菌，計算保護率，進行