牛源A型多殺性巴氏桿菌溶血特性分析及滅活疫苗候選菌株篩選.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、牛源A型多殺性巴氏桿菌是一種條件致病菌,主要引起牛肺炎,近年來在我國不斷流行,嚴(yán)重影響著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。目前我國尚無針對A型多殺性巴氏桿菌的疫苗,給多殺性巴氏桿菌的防控帶來了極大困難。有報道,多殺性巴氏桿菌在厭氧條件下出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,但對溶血性的相關(guān)分析還研究較少。
   1、多殺性巴氏桿菌溶血特性比較及溶血相關(guān)基因ahpA相關(guān)研究
   本試驗就6株牛源A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ1-6)在雞血,兔血和羊血平板上的溶血特性

2、進(jìn)行比較,克隆并比對了6株菌的溶血相關(guān)基因ahpA,構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹,同時擴(kuò)增和比對分析了其上游調(diào)控序列。對有氧和厭氧條件下培養(yǎng)的多殺性巴氏桿菌的ahpA基因表達(dá)量進(jìn)行熒光定量分析。構(gòu)建PmCQ2菌株ahpA基因的原核表達(dá)載體(pET-32a-ahpA,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-21(DE3),觀察該重組菌溶血現(xiàn)象,對ahpA蛋白進(jìn)行免疫印跡分析和免疫保護(hù)性研究。結(jié)果顯示,PmCQ1能夠溶解雞血和兔血;PmCQ2、PmCQ4及PmCQ6能夠溶解3

3、種動物紅血球;PmCQ5僅能夠溶解兔血;而PmCQ3均不能溶解3種動物紅血球。PmCQ1-6 ahpA同源性達(dá)100%,且較為保守,上游調(diào)控序列也一致。ahpA基因在有氧條件下不表達(dá),僅在厭氧條件下表達(dá),且各株菌間表達(dá)量差異顯著。重組菌在厭氧條件下溶血,有氧培養(yǎng)不溶血。通過免疫印跡分析和攻毒保護(hù)試驗,證實ahpA蛋白是一種良好的免疫原。本研究結(jié)果初步表明,多殺性巴氏桿菌的溶血差異性與ahpA基因的表達(dá)量存在一定關(guān)聯(lián);ahpA蛋白具有良好

4、的免疫活性。
   2、A型多殺性巴氏桿菌滅活疫苗侯選菌株篩選
   通過Reed-Muench法計算6株多殺性巴氏桿菌PmCQ1-6對小鼠的LD50(毒力測定)。結(jié)果顯示PmCQ1-6對昆明鼠的LD50分別為3.18×105CFU,2.2×105CFU,6.54×105CFU,3.45×105CFU,3.0×105CFU和1.14×108CFU,以PmCQ2毒力最強(qiáng),PmCQ6毒力明顯低于其他5株。通過交互免疫試驗對6

5、株菌進(jìn)行免疫原性的分析,結(jié)果顯示,PmCQ1-6組交互試驗的保護(hù)率分別為88.57%,85.71%,77.14%,80%,60%和80%,以PmCQ1保護(hù)效果最好,PmCQ2次之,PmCQ5最差。將PmCQ2連續(xù)傳代,通過接種生化鑒定管,比較原代、第90代和第150代的生化遺傳穩(wěn)定性;通過小鼠攻毒試驗,比較原代、第90代和第150代的毒力遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明,PmCQ2的生化和毒力遺傳穩(wěn)定性均較好。綜上,PmCQ2可以作為滅活疫苗的候選

6、菌株。
   3、疫苗制備及成品檢驗
   經(jīng)過菌液培養(yǎng)、計數(shù)、滅活、油相制備、水相制備和配苗乳化等程序,獲得滅活疫苗250mL,含菌量為4×109CFU/mL。接種200μL滅活疫苗于馬丁肉湯平板培養(yǎng),觀察有無雜菌生長,進(jìn)行無菌檢驗;注射家兔疫苗5mL/只,觀察10天,進(jìn)行安全檢驗;將疫苗分為0.5mL,1mL,1.5mL3個梯度免疫家兔,對照組免疫無菌PBS,21天后攻毒1MLD的A型多殺性巴氏桿菌,計算保護(hù)率,進(jìn)行

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