胃癌細(xì)胞CXCL12啟動(dòng)子異常甲基化導(dǎo)致表達(dá)沉默的研究.pdf

1、目的和意義：
　　 隨著研究的不斷深入,近幾年許多新型趨化因子及其受體基因不斷地被發(fā)現(xiàn),人們對(duì)于多種趨化因子及其受體的生物學(xué)活性和作用機(jī)理有了更深入的研究,對(duì)趨化因子超家族的結(jié)構(gòu)與功能有了更全面的了解。趨化因子是由不同類型細(xì)胞分泌的能使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的低分子質(zhì)量的細(xì)胞因子。趨化因子受體是一類表達(dá)于不同類型細(xì)胞上的能與趨化因子結(jié)合的含有七個(gè)跨膜區(qū)的G蛋白耦聯(lián)受體,在正常和非正常生理狀況下都起重要作用。
　　 在趨化因子及

2、受體中研究較為成熟的是CXCR4/CXCL12軸。CXCR4/CXCL12軸不僅在正常機(jī)體生理調(diào)節(jié)中具有重要作用,目前研究認(rèn)為其與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。大量的研究證實(shí)在多數(shù)惡性腫瘤中,腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)有趨化因子的受體CXCR4,轉(zhuǎn)移器官存在著高表達(dá)的趨化因子CXCL12,從而使得腫瘤細(xì)胞可以受趨化作用,發(fā)生器官特異性的轉(zhuǎn)移活動(dòng)。近來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌、乳腺癌腫瘤細(xì)胞中趨化因子CXCL12表達(dá)下調(diào)甚至不表達(dá)。而導(dǎo)致CXC

3、L12表達(dá)下調(diào)的主要原因可能是其啟動(dòng)子發(fā)生甲基化,從而抑制了腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性趨化因子的表達(dá)。
　　 本研究旨在探討CXCL12在胃癌中的表達(dá)情況以及可能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。首先我們?cè)诮M織水平上檢測(cè)CXCL12的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)胃癌組織中存在CXCL12表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象,我們通過檢測(cè)CXCL12啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)分析其是否與CXCL12表達(dá)下調(diào)相關(guān)以及CXCL12表達(dá)下調(diào)和啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。研究的第二部分我們

4、進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)研究胃癌細(xì)胞株在去甲基化制劑的作用下CXCL12表達(dá)是否可以逆轉(zhuǎn),以及觀察去甲基化制劑5-Aza-dC對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響,探討5-Aza-dC藥物調(diào)控的意義及治療胃癌的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　 2009年7月～2010年6月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科行根治性手術(shù)治療的胃癌患者癌和癌旁組織配對(duì)共73例;人胃癌細(xì)胞株MGC-803、BGC-823

5、、SGC-7901、HGC-27、AGS、MKN-45和永生化正常人胃細(xì)胞株GES1以及人腹膜間皮細(xì)胞株HMrSV5。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng):GES1、MGC-803、BGC-823、SGC-7901、HGC-27、AGS、MKN-45和HMrSV5按常規(guī)培養(yǎng)。
　　 2、半定量RT-PCR和定量RT-PCR檢測(cè)CXCL12基因mRNA在組織和細(xì)胞水平的表達(dá)。
　　 3、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)

6、8株細(xì)胞CXCL12蛋白表達(dá)位置。
　　 4、流式細(xì)胞儀通過分析平均熒光強(qiáng)度檢測(cè)8株細(xì)胞CXCL12蛋白表達(dá)含量。
　　 5、免疫組織化學(xué)檢測(cè)胃癌和癌旁組織中CXCL12蛋白表達(dá)水平。
　　 6、甲基化特異性PCR法檢測(cè)CXCL12基因DNA啟動(dòng)子甲基化狀況。
　　 7、去甲基化制劑5-Aza-dC處理CXCL12表達(dá)下調(diào)的胃癌細(xì)胞株。
　　 8、應(yīng)用阿爾瑪藍(lán)檢測(cè)5-Aza-dC處理后MKN-45

7、細(xì)胞活力。
　　 9、應(yīng)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5-Aza-dC處理后MKN-45細(xì)胞侵襲能力變化。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分胃癌組織CXCL12表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化的研究
　　 1、免疫組化結(jié)果顯示CXCL12表達(dá)在正常胃粘膜細(xì)胞和分化較好的胃癌細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)。CXCL12蛋白在73例胃癌組織中表達(dá)水平(中位數(shù)=0.006150,范圍=0.000090-0.147000)低于癌旁正常組織(中位

8、數(shù)=0.0258000,范圍=0.000050-0.227000),差異顯著(P＜0.01)。
　　 2、RT-PCR結(jié)果顯示48例胃癌組織CXCL12mRNA(中位數(shù)=0.25515,范圍=0.05890-3.13540)表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)癌旁組織(中位數(shù)=0.42860,范圍-0.06220-3.97220),差異顯著(P＜0.05)。
　　 3、35例胃癌組織中CXCL12基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率為65.7％,部

9、分甲基化發(fā)生率為22.9％,非甲基化率為11.4％。而相應(yīng)的癌旁正常組織中CXCL12基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化、部分甲基化、非甲基化發(fā)生率分別為11.4％、11.4％、77.1％。CXCL12基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率顯著高于癌旁正常組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4、胃癌組織CXCL12蛋白表達(dá)水平與組織分化程度(P＜0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(P＜0.05)密切相關(guān);CXCL12mRNA表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(P

10、＜0.05)密切相關(guān);而胃癌組織中CXCL12基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的發(fā)生率與年齡、性別、臨床病理分期、腫瘤分化程度等臨床病理資料無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。第二部分胃癌細(xì)胞CXCL12表達(dá)及5-Aza-dC誘導(dǎo)CXCL12去甲基化的實(shí)驗(yàn)研究
　　 1、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CXCL12表達(dá)在GES1、HMrSV5、HGC-27、AGS細(xì)胞核周圍的胞漿部分。胃癌細(xì)胞株CXCL12mRNA和蛋白水平明顯低于GES1和HMrSV5,差異均

11、有顯著性(P＜0.05),并且高侵襲、高轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞SGC-7901、MKN-45CXCL12mRNA和蛋白水平低于其他各胃癌細(xì)胞株(P＜0.05)。
　　 2、甲基化特異性PCR檢N8株細(xì)胞CXCL12啟動(dòng)子甲基化情況,MGC-803、SGC-7901、MKN-45顯示CXCL12基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化;BGC-823、HGC-27、AGS為部分甲基化而GES1、HMrSV5則顯示非甲基化。
　　 3、對(duì)CXCL12低表

12、達(dá)的胃癌細(xì)胞株MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45采用去甲基化制劑5-Aza-dC處理。結(jié)果顯示除BGC-823在作用前后CXCL12表達(dá)水平未見明顯差異(P＞0.05)外,MGC-803、SGC-7901、MKN-45細(xì)胞株在去甲基化制劑作用后mRNA和蛋白水平明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4、去甲基化制劑5-Aza-dC抑制高侵襲、高轉(zhuǎn)移能力的胃癌細(xì)胞株MKN-45增殖,降低

13、了MKN-45細(xì)胞的侵襲能力。
　　 結(jié)論：
　　 1、胃癌組織中存在CXCL12表達(dá)下調(diào),且與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和胃癌分化程度密切相關(guān)。
　　 2、CXCL12啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常甲基化可能是胃癌組織CXCL12表達(dá)水平下調(diào)的機(jī)制之一。
　　 3、在人胃癌細(xì)胞株亦存在CXCL12表達(dá)下調(diào),其中MGC-803、SGC-7901和MKN-45胃癌細(xì)胞CXCL12表達(dá)下調(diào)為啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化引起,利用去甲基化制