胃癌細胞CXCL12啟動子異常甲基化導致表達沉默的研究.pdf

1、目的和意義：
　　 隨著研究的不斷深入,近幾年許多新型趨化因子及其受體基因不斷地被發(fā)現(xiàn),人們對于多種趨化因子及其受體的生物學活性和作用機理有了更深入的研究,對趨化因子超家族的結構與功能有了更全面的了解。趨化因子是由不同類型細胞分泌的能使細胞發(fā)生趨化運動的低分子質量的細胞因子。趨化因子受體是一類表達于不同類型細胞上的能與趨化因子結合的含有七個跨膜區(qū)的G蛋白耦聯(lián)受體,在正常和非正常生理狀況下都起重要作用。
　　 在趨化因子及

2、受體中研究較為成熟的是CXCR4/CXCL12軸。CXCR4/CXCL12軸不僅在正常機體生理調節(jié)中具有重要作用,目前研究認為其與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移密切相關。大量的研究證實在多數惡性腫瘤中,腫瘤細胞表面表達有趨化因子的受體CXCR4,轉移器官存在著高表達的趨化因子CXCL12,從而使得腫瘤細胞可以受趨化作用,發(fā)生器官特異性的轉移活動。近來的實驗研究發(fā)現(xiàn)在結腸癌、乳腺癌腫瘤細胞中趨化因子CXCL12表達下調甚至不表達。而導致CXC

3、L12表達下調的主要原因可能是其啟動子發(fā)生甲基化,從而抑制了腫瘤細胞內源性趨化因子的表達。
　　 本研究旨在探討CXCL12在胃癌中的表達情況以及可能的分子調節(jié)機制。首先我們在組織水平上檢測CXCL12的表達水平,發(fā)現(xiàn)胃癌組織中存在CXCL12表達下調的現(xiàn)象,我們通過檢測CXCL12啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)分析其是否與CXCL12表達下調相關以及CXCL12表達下調和啟動子區(qū)異常甲基化與臨床病理學特征的關系。研究的第二部分我們

4、進一步通過體外實驗研究胃癌細胞株在去甲基化制劑的作用下CXCL12表達是否可以逆轉,以及觀察去甲基化制劑5-Aza-dC對胃癌細胞增殖和侵襲能力的影響,探討5-Aza-dC藥物調控的意義及治療胃癌的潛在臨床應用價值
　　 實驗方法：
　　 一、實驗對象
　　 2009年7月～2010年6月中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科行根治性手術治療的胃癌患者癌和癌旁組織配對共73例;人胃癌細胞株MGC-803、BGC-823

5、、SGC-7901、HGC-27、AGS、MKN-45和永生化正常人胃細胞株GES1以及人腹膜間皮細胞株HMrSV5。
　　 二、實驗方法
　　 1、細胞培養(yǎng):GES1、MGC-803、BGC-823、SGC-7901、HGC-27、AGS、MKN-45和HMrSV5按常規(guī)培養(yǎng)。
　　 2、半定量RT-PCR和定量RT-PCR檢測CXCL12基因mRNA在組織和細胞水平的表達。
　　 3、細胞免疫熒光檢測

6、8株細胞CXCL12蛋白表達位置。
　　 4、流式細胞儀通過分析平均熒光強度檢測8株細胞CXCL12蛋白表達含量。
　　 5、免疫組織化學檢測胃癌和癌旁組織中CXCL12蛋白表達水平。
　　 6、甲基化特異性PCR法檢測CXCL12基因DNA啟動子甲基化狀況。
　　 7、去甲基化制劑5-Aza-dC處理CXCL12表達下調的胃癌細胞株。
　　 8、應用阿爾瑪藍檢測5-Aza-dC處理后MKN-45

7、細胞活力。
　　 9、應用Transwell侵襲實驗檢測5-Aza-dC處理后MKN-45細胞侵襲能力變化。
　　 結果：
　　 第一部分胃癌組織CXCL12表達及啟動子甲基化的研究
　　 1、免疫組化結果顯示CXCL12表達在正常胃粘膜細胞和分化較好的胃癌細胞的細胞漿內。CXCL12蛋白在73例胃癌組織中表達水平(中位數=0.006150,范圍=0.000090-0.147000)低于癌旁正常組織(中位

8、數=0.0258000,范圍=0.000050-0.227000),差異顯著(P＜0.01)。
　　 2、RT-PCR結果顯示48例胃癌組織CXCL12mRNA(中位數=0.25515,范圍=0.05890-3.13540)表達水平明顯低于相應癌旁組織(中位數=0.42860,范圍-0.06220-3.97220),差異顯著(P＜0.05)。
　　 3、35例胃癌組織中CXCL12基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率為65.7％,部

9、分甲基化發(fā)生率為22.9％,非甲基化率為11.4％。而相應的癌旁正常組織中CXCL12基因啟動子區(qū)甲基化、部分甲基化、非甲基化發(fā)生率分別為11.4％、11.4％、77.1％。CXCL12基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率顯著高于癌旁正常組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4、胃癌組織CXCL12蛋白表達水平與組織分化程度(P＜0.05)和淋巴結轉移情況(P＜0.05)密切相關;CXCL12mRNA表達水平與淋巴結轉移情況(P

10、＜0.05)密切相關;而胃癌組織中CXCL12基因啟動子區(qū)甲基化的發(fā)生率與年齡、性別、臨床病理分期、腫瘤分化程度等臨床病理資料無明顯關聯(lián)(P＞0.05)。第二部分胃癌細胞CXCL12表達及5-Aza-dC誘導CXCL12去甲基化的實驗研究
　　 1、細胞免疫熒光實驗檢測CXCL12表達在GES1、HMrSV5、HGC-27、AGS細胞核周圍的胞漿部分。胃癌細胞株CXCL12mRNA和蛋白水平明顯低于GES1和HMrSV5,差異均

11、有顯著性(P＜0.05),并且高侵襲、高轉移能力的細胞SGC-7901、MKN-45CXCL12mRNA和蛋白水平低于其他各胃癌細胞株(P＜0.05)。
　　 2、甲基化特異性PCR檢N8株細胞CXCL12啟動子甲基化情況,MGC-803、SGC-7901、MKN-45顯示CXCL12基因啟動子區(qū)甲基化;BGC-823、HGC-27、AGS為部分甲基化而GES1、HMrSV5則顯示非甲基化。
　　 3、對CXCL12低表

12、達的胃癌細胞株MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45采用去甲基化制劑5-Aza-dC處理。結果顯示除BGC-823在作用前后CXCL12表達水平未見明顯差異(P＞0.05)外,MGC-803、SGC-7901、MKN-45細胞株在去甲基化制劑作用后mRNA和蛋白水平明顯增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4、去甲基化制劑5-Aza-dC抑制高侵襲、高轉移能力的胃癌細胞株MKN-45增殖,降低

13、了MKN-45細胞的侵襲能力。
　　 結論：
　　 1、胃癌組織中存在CXCL12表達下調,且與胃癌淋巴結轉移和胃癌分化程度密切相關。
　　 2、CXCL12啟動子區(qū)CpG島的異常甲基化可能是胃癌組織CXCL12表達水平下調的機制之一。
　　 3、在人胃癌細胞株亦存在CXCL12表達下調,其中MGC-803、SGC-7901和MKN-45胃癌細胞CXCL12表達下調為啟動子區(qū)異常甲基化引起,利用去甲基化制