HBc病毒樣顆粒在篩選多功能單克隆抗體中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：乙肝病毒核心蛋白可自我組裝成病毒樣顆粒(VLP)，HBc-VLP作為表位遞呈系統(tǒng)可用于攜帶外源表位。除了應(yīng)用于VLP疫苗和表位疫苗以外，VLP還可用于病毒顆粒的攝取，病毒藥物活性以及樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)的抗原遞呈功能等研究中。然而，發(fā)現(xiàn)一些商業(yè)化單克隆抗體并不能特異性識(shí)別HBc-VLP，同樣也無(wú)法應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)病毒樣顆粒的定位研究，于是不得不購(gòu)買大量單抗以找到一種合適的，這一過(guò)程無(wú)疑費(fèi)力又費(fèi)錢。因次，要制備出一個(gè)HBc-VLP特異性

2、多功能單克隆抗體以滿足多種研究的不同需要。 方法： ①構(gòu)建與表達(dá)HBV核心抗原：截短的HBc基因(aa1-144)通過(guò)PCR擴(kuò)增而來(lái)，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后，轉(zhuǎn)入表達(dá)載體pET-28a。陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BL21(DE3)大腸桿菌菌株，用IPTG誘導(dǎo)； ②快速純化重組HBc蛋白：離心獲得濕重為9克的菌體，重懸加入溶菌酶后超聲破菌獲得包含體。將包含體加入10ml變性緩沖液(50mM Tris-HCL，pH8.0和0.1M尿素

3、)，不能溶解的成分通過(guò)離心(30 min 12000g)去除。用復(fù)性緩沖液稀釋至2mg/ml的濃度。復(fù)性蛋白溶液用雙蒸水(PH6.0)透析以去除殘留的尿素。并用SDS-PAGE確定其純度； ③電鏡分析所制備的VLP； ④制備抗HBc-VLP單克隆抗體：用HBc-VLP(aa1-144)作為免疫原來(lái)免疫BALB/c雌鼠。經(jīng)過(guò)幾次免疫后，將抗體滴度高的BALB/c鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。先用ELISA篩選，再進(jìn)

4、行westem印跡分析以進(jìn)一步篩選，獲得HBc-VLP特異性抗體； ⑤鼠單核.巨噬細(xì)胞系RAW264.7的吞噬作用的檢測(cè)； ⑥利用共聚焦激光掃描顯微鏡對(duì)HBc-VLP表位疫苗的攝取過(guò)程進(jìn)行觀察； ⑦HepG2.2.15細(xì)胞中活HBV的觀察：將HepG2.2.15細(xì)胞接種于玻片上并培養(yǎng)，以觀察先前所篩選的陽(yáng)性單抗是否能與自然病毒顆粒反應(yīng)。HepG2細(xì)胞作為陰性對(duì)照。 結(jié)果： ①成功構(gòu)建了pET-28

5、a-HBc(aa1-144)，經(jīng)SDS-PAGE分析，其所表達(dá)的目的蛋白分子量為19kDa； ②經(jīng)western印跡分析驗(yàn)證該目的蛋白的確具備HBc抗原的免疫原性； ③0.1M尿素所溶解的HBc蛋白可形成病毒樣顆粒；經(jīng)超純水透析后的HBc-VLP的結(jié)構(gòu)更加規(guī)則統(tǒng)一； ④用HBc-VLP作為免疫原來(lái)免疫BALB/c雌鼠通過(guò)ELISA和western印跡分析篩選到5個(gè)HBc-VLP特異性抗體； ⑤篩選到3個(gè)可

6、與被APC攝取的HBc-VLP相結(jié)合的特異性單抗。這三個(gè)單抗的編號(hào)分別為3H2D7-F6，1H7D7-D2和3B8E6-D3； ⑥利用HepG2.2.15細(xì)胞系篩選到1個(gè)單抗能特異性結(jié)合自然狀態(tài)下的HBc顆粒，此單抗編號(hào)為3H2D7-F6。 結(jié)論： ①以截短的HBc-VLP骨架作免疫原，以此表位遞呈系統(tǒng)為篩選平臺(tái)，最終篩選出1個(gè)可用于鑒定HBc-VLP，嵌合體HBc-VLP疫苗和細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒衣殼蛋白的抗體。該抗