HO-1、SR-BⅠ和RAS在動脈粥樣硬化發(fā)生中表達及相互作用的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、研究背景： 心、腦血管疾病是嚴重危害人民健康的疾病之一，其共同的病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化(AS)。AS的確切病因尚未完全闡明，其發(fā)生發(fā)展過程中存在一系列的致病危險因素，如高脂血癥、糖尿病等，但機體也存在一系列的抗AS因素，近年來發(fā)現(xiàn)的血紅素氧和酶(HO)系統(tǒng)和膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(RCT)過程均對機體具有抗AS的保護作用，已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點領(lǐng)域之一。 HO是血紅素降解的起始酶和限速酶，它催化血紅素產(chǎn)生膽綠素、一氧化碳(CO)

2、和游離鐵。膽綠素由膽綠素還原酶還原為膽紅素，游離鐵與脫鐵鐵蛋白結(jié)合成為鐵蛋白。HO-1為HO的誘導(dǎo)型，廣泛分布于全身細胞和組織，其酶活性在缺氧、氧化應(yīng)激、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、重金屬、血紅素、內(nèi)毒素和熱休克應(yīng)激等多種因素誘導(dǎo)下明顯增高。 血紅素是一種強的致氧化物，能誘導(dǎo)細胞內(nèi)氧化反應(yīng)。研究表明，HO主要通過其分解血紅素及血紅素分解后的代謝產(chǎn)物膽綠素、膽紅素、鐵蛋白的抗氧化作用和CO的擴張血管、抗炎、抗增殖作用

3、對細胞產(chǎn)生保護作用。 正常血管內(nèi)皮細胞和VSMC中只有極少量HO-1表達，而在大鼠、家兔AS模型中發(fā)現(xiàn)粥樣斑塊中有HO-1表達。他汀類藥物能有效地降低LDL-C及提高HDL-C，但關(guān)于他汀對AS血管中HO-1表達影響的研究，國內(nèi)尚未見有報道。 AS的成因與脂質(zhì)代謝失調(diào)密切相關(guān)。流行病學(xué)和臨床研究表明，血漿或血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平與AS的發(fā)病率呈正相關(guān)，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平則與

4、AS的發(fā)病率呈負相關(guān)。B族Ⅰ型清道夫受體(SR-Bl)是第一個分子和功能定義明確的高密度脂蛋白(HDL)受體。 HDL將多余膽固醇從周圍組織(包括動脈粥樣斑塊)轉(zhuǎn)運到肝臟進行再循環(huán)或以膽酸的形式排泄，這一過程稱作RCT。研究表明，SR-Bl參與外周組織中膽固醇的流出和肝臟及類固醇激素生成組織中膽固醇的選擇性攝取，在RCT中起著關(guān)鍵作用。 研究證實人主動脈和冠狀動脈的AS病變部位均存在SR-BI的高表達，但關(guān)于SR-B

5、l在AS血管的表達及他汀類藥物對SR-Bl影響的研究，國內(nèi)尚未見有報道。 研究表明，腎素一血管緊張素系統(tǒng)(RAS)參與了AS的發(fā)生過程。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要活性成分，通過促進細胞增殖、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、促進細胞凋亡、促進ox-LDL攝取、產(chǎn)生氧自由基等多方面參與AS的病理過程。 AngⅡ的生物學(xué)作用是通過其受體實現(xiàn)的，AngⅡ受體主要有．AT<,1>和AT<,2>兩個亞型。幾乎所有AngⅡ?qū)Τ赡杲M織的效應(yīng)

6、均由AT<,1>介導(dǎo)，AT<,2>的功能目前尚未完全闡明，可能主要與組織重構(gòu)和生長發(fā)育有關(guān)。AS血管中AT<,1>表達增加，但有關(guān)AT<,2>表達變化的研究較少，而且結(jié)果存在差異。另外，有關(guān)他汀對AT<,2>表達影響的研究，至今國內(nèi)外尚未見有報道。 國內(nèi)外的研究均證實HO-l、SR-BI和RAS參與了AS的發(fā)生過程，而且國外有研究顯示AngⅡ?qū)O-l和SR-BI的表達具有調(diào)節(jié)作用，但關(guān)于他汀對高脂血癥和AS大鼠HO-l、SR

7、-BI、RAS的影響及它們間相互作用的研究較少，而且國內(nèi)尚未見有報道。本課題將結(jié)合對大鼠主動脈病理學(xué)的觀察及他汀的藥物干預(yù)從mRNA和蛋白質(zhì)水平同時對以上問題進行探討，以進一步闡明AS發(fā)生的分子機制及RAS與HO-l、SR-BI之間相互作用的內(nèi)在聯(lián)系。 目的： (1)建立大鼠高脂血癥及AS模型； (2)觀察高脂血癥和AS大鼠主動脈病理學(xué)的變化； (3)研究高脂血癥和AS大鼠主動脈HO-l、SR-BI、An

8、gⅡ、AT<,1>和AT<,2>表達的變化，揭示它們在AS發(fā)生中的作用；(4)探討辛伐他汀對HO-1、SR-B Ⅰ、AngⅡ、AT<,1>和AT<,2>影響的調(diào)脂外作用，即多效性作用； (5)闡明HO-1、SR-B Ⅰ與RAS在AS發(fā)生中的相互作用及內(nèi)在聯(lián)系。方法 1建立大鼠高脂血癥和AS模型：將36只大鼠隨機分為對照組(n=8)、高脂血癥組(高脂組，n=8)、動脈粥樣硬化組(AS組，n=10)和他汀治療組(他汀

9、組，n=10)。對照組：普通飼料喂養(yǎng)；高脂組：單純高脂飼料喂養(yǎng)；AS組：高脂喂養(yǎng)+VitD<,3>+球囊損傷；他汀組：高脂喂養(yǎng)+VitD<,3>+球囊損傷+辛伐他汀。VitD<,3>:30萬單位/Kg/4w，肌肉注射；球囊損傷：即主動脈內(nèi)皮球囊損傷術(shù)；辛伐他?。?0mg/Kg/d，灌胃。4周時頸靜脈取血測血脂；12周時處死大鼠，取其血清、血漿及主動脈組織進行檢測。 2全自動生化儀檢測大鼠血清TC、TG、HDL、LDL和膽紅素

10、水平； 3放射免疫法檢測大鼠血漿及主動脈的AngⅡ水平； 4油紅O染色觀察大鼠主動脈斑塊形成的情況； 5常規(guī)HE染色和Masson染色觀察大鼠主動脈各層和細胞結(jié)構(gòu)的變化； 6免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠主動脈AT<,1>、AT<,2>、HO-1及SR-BI蛋白表達的定位情況； 7Westem blot技術(shù)定量檢測大鼠主動脈AT<,1>、AT<,2>、HO-1及SR-B I

11、的蛋白表達水平； 8逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerse chain reaction，RT-PCR)方法定量檢測大鼠主動脈AT<,1>、AT<,2>、:HO-1和SR-B I的mRNA表達水平。 9統(tǒng)計學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均采用 ±s表示，采用SPSS 12.0分析軟件，計量資料分析采用方差分析，變量之間的相關(guān)關(guān)系采用Microsoft Excel進行直線相關(guān)分析

12、。P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 1．高脂喂養(yǎng)、VitD<,3>和主動脈內(nèi)皮損傷共同作用可成功建立大鼠早期主動脈粥樣硬化模型。 2．動脈粥樣硬化形成過程中，血紅素氧合酶-1(HO-1)、主動脈清道夫受體B Ⅰ(SR-B Ⅰ)、血管緊張素Ⅱ2型受體(AT<,2>)表達升高，對機體產(chǎn)生抗動脈粥樣硬化的保護作用。 3．動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的過程中，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)產(chǎn)生增加，血管緊張素Ⅱ1型受

13、體(AT<,1>)表達上調(diào)，促進動脈粥樣硬化病變的形成。 4．辛伐他汀不僅能明顯降低高脂血癥及動脈粥樣硬化大鼠的總膽固醇和低密度脂蛋白水平，減輕其主動脈粥樣硬化的程度，而且通過抑制AngⅡ生成，增加膽紅素產(chǎn)生，下調(diào)AT<,1>表達，上調(diào)AT<,2>、HO-1和SR-BⅠ的表達，對機體產(chǎn)生抗動脈粥樣硬化的保護作用。 5.動脈粥樣硬化大鼠主動脈AngⅡ的水平與HO-1、SR-BⅠ、AT<,1>和AT<,2>的蛋白表達