外源性基因經(jīng)乳腺管注射在大鼠乳腺中表達(dá)的機(jī)理研究.pdf

1、乳腺生物反應(yīng)器屬于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的范疇，自轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)立以來(lái)，幾十年里取得了巨大進(jìn)展，擁有著廣闊的應(yīng)用前景。從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺中獲得珍貴醫(yī)用人類(lèi)蛋白質(zhì)是現(xiàn)代生物技術(shù)學(xué)應(yīng)用的重要領(lǐng)域。乳腺導(dǎo)管注射可以用來(lái)制作乳腺生物反應(yīng)器，本實(shí)驗(yàn)的目的是為了研究外源性基因經(jīng)乳腺導(dǎo)管注射在大鼠乳腺中表達(dá)的機(jī)理，探索提高基因轉(zhuǎn)染效率的對(duì)策。 本實(shí)驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容分為三個(gè)部分。 在第一部分實(shí)驗(yàn)中，取8個(gè)不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)(4周齡、9周齡未孕、妊娠7天、妊娠

2、12天、妊娠18天、產(chǎn)后1周、產(chǎn)后2周、產(chǎn)后3周)的雌性大鼠乳腺組織進(jìn)行普通石蠟切片、HE染色，在光鏡下觀(guān)察其形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：大鼠的乳腺是復(fù)管泡腺，其發(fā)育過(guò)程中形態(tài)學(xué)變化最明顯的時(shí)間是在妊娠12天至產(chǎn)后14天，表現(xiàn)為大量漿液性腺泡的腺細(xì)胞不斷增生及分泌活動(dòng)，其中在妊娠12天和產(chǎn)后1周可以發(fā)現(xiàn)數(shù)量相對(duì)較多的處于分裂期的腺細(xì)胞。大鼠的乳腺發(fā)育過(guò)程主要是在孕期和泌乳期完成的，發(fā)育隨妊娠的開(kāi)始而進(jìn)行，隨泌乳的結(jié)束而退化。另取同一發(fā)育時(shí)期的

3、大鼠乳腺制作卡紅染色的全組織片，觀(guān)察了乳腺導(dǎo)管在發(fā)育過(guò)程中的整體變化。發(fā)現(xiàn)4周齡時(shí)，大鼠乳腺主要由細(xì)長(zhǎng)而稀疏的導(dǎo)管構(gòu)成，導(dǎo)管極少有側(cè)枝；9周齡時(shí)乳腺導(dǎo)管的主干上發(fā)出較多側(cè)枝，并且末端出現(xiàn)端芽；妊娠后，乳腺導(dǎo)管增粗，側(cè)枝更加密集，末球出現(xiàn)并逐漸增多；產(chǎn)后，乳腺導(dǎo)管基本維持在妊娠末期的形態(tài)特點(diǎn)；哺乳結(jié)束后乳腺導(dǎo)管恢復(fù)成妊娠前的狀態(tài)。 第二部分進(jìn)行了外源性基因在體外培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，外源性基因選擇的是pCE-29質(zhì)粒，它是高效的綠

4、色熒光蛋白(GFP)真核表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)中首先擴(kuò)增已轉(zhuǎn)染有pCE-29質(zhì)粒的DH5α細(xì)菌，而后采取抽提的方法，得到含pCE-29質(zhì)粒的溶液。經(jīng)過(guò)紫外/可見(jiàn)分光度計(jì)測(cè)得溶液濃度為5.288ug/ul，純度為1.8240(A260/A280)，符合基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)要求。質(zhì)粒經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ酶切，所得產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后的結(jié)果表明：質(zhì)粒結(jié)構(gòu)完整、序列正確；而后利用NucleofectoTMManual轉(zhuǎn)染儀對(duì)處于指數(shù)生長(zhǎng)期

5、的小鼠乳腺癌細(xì)胞MA782進(jìn)行了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，結(jié)果培養(yǎng)細(xì)胞可以表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)。提示在體外條件下，對(duì)于一個(gè)細(xì)胞群體而言，如果其中處于分裂期的細(xì)胞較多，那么可能這一細(xì)胞群體接受外源基因的機(jī)率也較大。 在第三部分的實(shí)驗(yàn)中，依據(jù)乳腺發(fā)育時(shí)期的不同(即未孕、妊娠7天、妊娠12天、妊娠18天、產(chǎn)后1周、產(chǎn)后2周)將36只雌性SD大鼠分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)組(6只/組)，以質(zhì)粒pCE-29與脂質(zhì)體Invivo-jetPEITM依不同比例混合后制

6、成不同的轉(zhuǎn)染液，分別經(jīng)乳腺管注射和乳腺組織直接注射兩種方式導(dǎo)入各組大鼠的不同乳腺，48小時(shí)后處死大鼠，取材、冰凍切片，熒光顯微鏡下觀(guān)察各組大鼠乳腺中GFP的表達(dá)情況。如果有GFP表達(dá)則對(duì)該張冰凍切片再進(jìn)行HE染色，通過(guò)前后圖像對(duì)比來(lái)準(zhǔn)確定位GFP的表達(dá)位置。結(jié)果在妊娠12天和產(chǎn)后1周這兩組中，pCE-29質(zhì)粒與脂質(zhì)體Invivo-jetPEITM依(N/P=10)的比例混合后經(jīng)乳腺導(dǎo)管注射，質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)入腺泡細(xì)胞中而得到表達(dá)，而經(jīng)乳腺組織

7、直接注射的實(shí)驗(yàn)對(duì)象中未發(fā)現(xiàn)有GFP的表達(dá)。分析以上結(jié)果，認(rèn)為采用乳腺注射進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)時(shí)，為提高外源基因的轉(zhuǎn)染效率可能應(yīng)關(guān)注以下幾個(gè)方面：1、基因轉(zhuǎn)染的時(shí)機(jī)：可能應(yīng)選擇乳腺內(nèi)細(xì)胞分裂活動(dòng)旺盛的時(shí)期。2、乳腺干細(xì)胞的影響：可能應(yīng)選擇在干細(xì)胞/祖細(xì)胞不斷分化的時(shí)期。3、轉(zhuǎn)染液中DNA與脂質(zhì)體的配比：應(yīng)根據(jù)轉(zhuǎn)染對(duì)象的不同選擇外源基因與脂質(zhì)體的合適配比。4、外源基因?qū)氲耐緩剑航?jīng)乳腺導(dǎo)管導(dǎo)入可能相對(duì)于乳腺組織直接注射效果更佳。5、乳腺中不同種類(lèi)

8、細(xì)胞的特性：可能乳腺中的不同細(xì)胞對(duì)外源基因的易感性是不同的。 本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)外源基因經(jīng)乳腺導(dǎo)管注射在乳腺細(xì)胞中表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行了研究，提出了當(dāng)乳腺細(xì)胞處于旺盛分裂增殖的起始階段時(shí)，可能這些不斷分裂的細(xì)胞接受外源性基因的機(jī)率較大，這些細(xì)胞可能來(lái)源于腺細(xì)胞中的干細(xì)胞或者祖細(xì)胞。在轉(zhuǎn)基因的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中創(chuàng)新性的采用了對(duì)同一切片不同狀態(tài)下的圖像進(jìn)行圖像分析來(lái)精確判定基因表達(dá)結(jié)果的新方法。實(shí)驗(yàn)中首先將新鮮冰凍組織切片在熒光顯微鏡熒光激發(fā)下觀(guān)察