中國不同地區(qū)間日瘧原蟲種群結(jié)構(gòu)及其在溯源檢測中的應(yīng)用.pdf

1、瘧疾是世界范圍內(nèi)危害最嚴(yán)重的一種蚊媒寄生蟲病，尤其是對非洲、南美以及東南亞地區(qū)產(chǎn)生極大危害。目前，全球每年瘧疾臨床發(fā)病人數(shù)為3-5億，其中100-300萬人死于該病，90％的死亡數(shù)發(fā)生在非洲，絕大部分是5歲以下的兒童。間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)是世界上分布最廣的瘧原蟲，雖然其致病的嚴(yán)重程度不如惡性瘧原蟲高，但是由于其具有更廣泛的適應(yīng)性和較高的復(fù)發(fā)率，它仍然給人們的健康，尤其是兒童帶來極大的危害。間日瘧的流行和發(fā)展對全

2、球的公共衛(wèi)生安全帶來重大的挑戰(zhàn)。在中南美洲，中東地區(qū)，中亞、南亞和東南亞以及大洋洲和東非地區(qū)，每年約有26億人受到間日瘧的威脅，其中包括7至8千萬的臨床病例；在巴西亞馬遜流域，間日瘧原蟲甚至已經(jīng)超過惡性瘧成為致死性瘧疾的主要病原體，其傳播和發(fā)病形式不容樂觀。在我國，經(jīng)過50多年不懈的努力，瘧疾的發(fā)病從整體上已經(jīng)得到有效控制，但近幾年來，我國一些地區(qū)的瘧疾疫情出現(xiàn)了回升趨勢，特別是安徽等地區(qū)出現(xiàn)了間日瘧的暴發(fā)流行。為應(yīng)對當(dāng)前瘧疾流行的嚴(yán)峻

3、形勢，仍需要加強(qiáng)瘧疾防治的基礎(chǔ)研究，特別是研發(fā)瘧疾防治相關(guān)的新技術(shù)，包括瘧疾感染的溯源檢測技術(shù)。
　　 在此項(xiàng)研究中，我們從云南、海南和華中三個不同流行地區(qū)采集間日瘧疾患者血樣本。云南地區(qū)樣本采集地區(qū)按照地理分布主要分為三個區(qū)域：(1)怒江流域：流行區(qū)包括德宏自治州和中緬邊界區(qū)域，樣本來源為騰沖縣、龍陵縣、德宏自治州及與緬甸接壤地區(qū)包括境外的緬甸克欽邦拉咱地區(qū)。(2)瀾滄江流域：流行區(qū)包括臨滄地區(qū)、思茅地區(qū)及西雙版納傣族自治州，

4、樣本來源為西雙版納傣族自治州的景洪市和勐臘縣。(3)紅河流域：流行區(qū)包括紅河自治州和文山自治州，樣本來源為紅河州紅河縣及元江縣。在云南地區(qū)共采集瘧疾患者血樣本共310份。海南地區(qū)樣本采集地包括三亞市，樂東縣和東方市三個地區(qū)，采集樣本數(shù)共計(jì)82份。華中地區(qū)樣本采集地包括安徽、湖北和河南三省，采集樣本數(shù)共計(jì)530份。所有樣本均采用試劑盒提取基因組DNA。參考目前國際廣泛應(yīng)用于地理株種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究的工具和方法，選擇間日瘧基因組不同染

5、色體上的23個微衛(wèi)星位點(diǎn)(MSs)對我國間日瘧原蟲進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)分析及遺傳多樣性研究，并通過一些地區(qū)特異性的位點(diǎn)初步建立溯源檢測的體系。這些微衛(wèi)星位點(diǎn)包括12.335、7.67、NA.1276、NA.2208、8.332、6.34、2.21、10.29、3.35、3.27、1.501、3.502、9-AT、14-AT、1-TCA、4-GAA、5-TCT-1、5-TCT-2、6-TAC、11-CAA、11-TGA、13-CTT、u2.6，d

6、4,其中前12個為引子文獻(xiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)，后12個為自行篩選的位點(diǎn)，核心重復(fù)單位為2至8個堿基不等。每個MS位點(diǎn)設(shè)計(jì)3條引物，其中1條為熒光標(biāo)記引物。采用半巢氏PCR方法擴(kuò)增每個微衛(wèi)星位點(diǎn)，第二輪PCR采用熒光標(biāo)記引物，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行GENESCAN檢測。檢測得到不同的片段長度，代表微衛(wèi)星等位基因的不同類型。我們還選擇了兩個SNPs位點(diǎn)作為溯源檢測的核心位點(diǎn)，這兩個位點(diǎn)與瘧原蟲抗藥性基因相關(guān)，實(shí)驗(yàn)證明它們具有地區(qū)特異性，使得初步建立溯源

7、檢測系統(tǒng)成為可能。我們對所有樣本微衛(wèi)星檢測結(jié)果進(jìn)行整理，并利用相應(yīng)的生物信息學(xué)的軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析。我們用GenALEx軟件進(jìn)行平均等位基因，期望雜合度以及方差分析，用在線分析軟件LIAN計(jì)算種群的連鎖不平衡性，Mega軟件用于繪制遺傳進(jìn)化樹圖，并進(jìn)行溯源相關(guān)的判別分析。
　　 我們發(fā)現(xiàn)所選擇的大部分MS位點(diǎn)在不同地區(qū)的樣本中具有高度的變異性，平均每個位點(diǎn)有5-33個等位基因，云南地區(qū)樣本的平均等位基因數(shù)目為14.27±1.6

8、3，期望雜合度為0.768±0.035，海南地區(qū)平均等位基因數(shù)目為8.53±0.98，期望雜合度為0.707±0.042，華中地區(qū)平均等位基因數(shù)目為10.27±1.33，期望雜合度為0.638±0.056。華中地區(qū)的樣本具有顯著的連鎖不平衡性(p＜0.001)。云南和海南地區(qū)樣本之間的遺傳距離更近為0.097,而華中地區(qū)的樣本和這兩個地區(qū)相距較遠(yuǎn)分別為0.161和0.197。在以上研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們嘗試用判別分析的方法初步探討旨在建

9、立間日瘧疾溯源檢測技術(shù)的判別系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個微衛(wèi)星位點(diǎn)在此系統(tǒng)中有良好的區(qū)分性，可作為中國這三大地區(qū)的特異性的分子標(biāo)記。另外，本實(shí)驗(yàn)其它研究發(fā)現(xiàn)的兩個SNPs和一個MS具有較好的區(qū)分性。采用三個MS和兩個SNP作為我國間日瘧溯源檢測的分子標(biāo)志，對我國三個間日瘧疾主要流行區(qū)樣本進(jìn)行溯源分析，結(jié)果顯示：海南地區(qū)的33個樣本均被正確判定為該地區(qū)樣本，正確率達(dá)到100％。華中地區(qū)181個樣本有179個被正確判定，其余2個樣本被判定為海南地區(qū)樣

10、本，正確率達(dá)到98.9％。云南地區(qū)92個樣本中有78個樣本被正確判定為該地區(qū)樣本，而分別有3個和11個樣本被判定為海南和華中地區(qū)樣本，判定的正確率為84.8％。三個地區(qū)總體結(jié)果有94.8％的樣本能夠正確地被判斷為來源地區(qū)的樣本，交叉驗(yàn)證的結(jié)果相同，有較高的判別符合率。最后，我們從華中地區(qū)選擇了未參與系統(tǒng)建立的20個樣本對此系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)華中地區(qū)驗(yàn)證結(jié)果均符合實(shí)際情況，正確率達(dá)到100％。
　　 綜合本研究結(jié)果表明，中國各

11、個地區(qū)間日瘧原蟲基因組具有較高的變異度，其種群結(jié)構(gòu)有顯著特點(diǎn)，從進(jìn)化上來看，云南和海南地區(qū)樣本遺傳關(guān)系更近，它們與華中地區(qū)樣本差異較大。而華中地區(qū)樣本在我們選擇的微衛(wèi)星位點(diǎn)上體現(xiàn)出顯著的連鎖不平衡性，提示該地區(qū)間日瘧原蟲的高近親繁殖率和低的基因組有效重組率。我們初步建立的溯源監(jiān)測系統(tǒng)具有良好的溯源檢測能力，判別符合率和驗(yàn)證正確率均達(dá)到90％以上。隨著樣本數(shù)的增加，此系統(tǒng)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性會進(jìn)一步提高，以期能為我國的瘧疾防治和瘧疾消除計(jì)劃提