中國安徽間日瘧原蟲DBPII克隆表達及其鑒定.pdf

1、目的：（1）克隆中國安徽流行區(qū)間日瘧原蟲達菲血型結(jié)合蛋白 II區(qū)基因（Plasmodium vivax Duffy Binding Protein region II，PvDBPII）；（2）體外原核表達和鑒定重組PvDBPII蛋白。
　　方法：（1）根據(jù)GenBank收錄的間日瘧原蟲Sa1-1株P(guān)vDBPII基因（GI：156081788）序列設(shè)計引物，從鏡檢陽性的間日瘧原蟲感染血樣本中抽提 DNA為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)從間日瘧

2、基因組DNA中擴增DBPII基因。PvDBPII PCR產(chǎn)物與pET-28a載體分別經(jīng)Nco I和Hind III雙酶切后連接克隆入原核表達載體pET28a(+)中，構(gòu)建pET28a(+)-PvDBPII重組表達質(zhì)粒，采用雙酶切及測序方法鑒定重組質(zhì)粒。（2）將重組質(zhì)粒pET28a(+)-PvDBPII轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21(DE3+)中，IPTG誘導(dǎo)表達帶有His標(biāo)簽的重組蛋白，采用鎳柱親和層析純化重組蛋白，采用 SDS-PAGE電泳

3、和Western Blotting分析鑒定表達產(chǎn)物。
　　結(jié)果：（1）PCR體外擴增得到目的基因片段長約1.1 kb。雙酶切及測序結(jié)果顯示目的基因己被正確地連接入重組質(zhì)粒 pET28a(+)中，其插入片段序列與Sa1-1株P(guān)vDBPII基因參考序列相比存在四個非同義突變位點（R319G、D384G、R390H和L424I）。（2）重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌后，誘導(dǎo)表達的重組蛋白分子量約為44 kDa，且能被間日瘧患者血漿特異性識別。在