我國惡性瘧原蟲種群結(jié)構(gòu)及其在溯源檢測中的應(yīng)用.pdf

1、瘧疾依然是威脅人類健康的重要熱帶傳染病。據(jù)估計全球每年瘧疾患病人數(shù)為3-5億,死亡病例在100萬以上。感染人類的瘧原蟲有四種,其中惡性瘧原蟲致病最為嚴重,可引發(fā)重型瘧疾包括腦型瘧和妊娠相關(guān)瘧疾。目前,我國惡性瘧病例主要集中在云南和海南兩省,流行趨勢并無減弱之勢；加之我國西南邊境人口流動頻繁及中非交流合作加強,陸續(xù)有“輸入性瘧疾”病例報道。在國際上,對不同地區(qū)的惡性瘧原蟲種群結(jié)構(gòu)和遺傳進化開展了廣泛的研究,這些研究已基本闡明全球其他地區(qū)惡

2、性瘧原蟲蟲株的遺傳變異特點,對全球瘧疾防治工作發(fā)揮重要的理論指導作用。然而,迄今對我國瘧原蟲種群結(jié)構(gòu)等相關(guān)研究尚未系統(tǒng)展開,與國際上其它地區(qū)相比,目前尚缺乏我國不同地區(qū)瘧原蟲種群結(jié)構(gòu)與基因多樣性遺傳數(shù)據(jù)庫。對此,本課題通過檢測惡性瘧原蟲不同染色體上的微衛(wèi)星分子標記,對我國不同地區(qū)惡性瘧原蟲進行種群結(jié)構(gòu)相關(guān)研究,旨在尋找和確定具有地區(qū)差異性的分子遺傳標記,為建立我國惡性瘧原蟲遺傳數(shù)據(jù)庫和惡性瘧原蟲溯源檢測技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。
　　

3、我們從云南和海南兩省不同流行地區(qū)采集惡性瘧疾患者血樣本。云南地區(qū)樣本采集地區(qū)按照地理分布主要分為三個區(qū)域:(1)怒江流域:流行區(qū)包括德宏自治州和中緬邊界區(qū)域,樣本來源為騰沖縣、龍陵縣、德宏自治州及與緬甸接壤地區(qū)包括境外的緬甸克欽邦拉咱地區(qū)。(2)瀾滄江流域:流行區(qū)包括臨滄地區(qū)、思茅地區(qū)及西雙版納傣族自治州,樣本來源為西雙版納傣族自治州的景洪市和勐臘縣。(3)紅河流域:流行區(qū)包括紅河自治州和文山自治州,樣本來源為紅河州紅河縣及元江縣。在云

4、南地區(qū)共采集瘧疾患者血樣本共341份。海南地區(qū)樣本采集地包括三亞市,樂東縣和東方市三個地區(qū),采集樣本數(shù)共計139份。所有樣本均采用試劑盒提取基因組DNA。參考目前國際廣泛應(yīng)用于地理株種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究的工具和方法,選擇惡性瘧基因組不同染色體上的12個微衛(wèi)星位點(MSs)對我國惡型瘧原蟲進行種群結(jié)構(gòu)分析及遺傳多樣性研究。這些微衛(wèi)星位點包括TA1、Polyα、PK2、TA81、TA109、TA42、TA40、TA60、ARA2、G37

5、7、2490和TA87,均為3個堿基重復類型。每個MS位點設(shè)計3條引物,其中1條為熒光標記引物。采用半巢氏PCR方法擴增每個微衛(wèi)星位點,第二輪PCR采用熒光標記引物,將PCR產(chǎn)物進行GENESCAN檢測。檢測得到不同的片段長度,代表微衛(wèi)星等位基因的不同類型。根據(jù)每個位點上檢測到的等位基因的類型和數(shù)目,對各地區(qū)感染樣本進行多重感染的分析。依據(jù)所要檢測的微衛(wèi)星位點變異特征,結(jié)合本課題實際情況,確定了區(qū)分單一感染和混合感染樣本的標準,即:在1

6、2個微衛(wèi)星位點中,若單一等位基因的位點大于或等于9個,則定義為單一感染樣本；若單一等位基因的位點少于9個,則定義為多重感染樣本。按此標準,六個地區(qū)的多重感染樣本的百分數(shù)為:云南怒江流域24.1％,云南瀾滄江流域12.2%,云南紅河流域為7.7%,海南三亞為4.3%,海南樂東為10.3%以及東方市為10.9%。分析各地區(qū)樣本的種群結(jié)構(gòu)時,需要排除多重感染樣本,將每個地區(qū)單一感染樣本數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。首先分析和計算出各地區(qū)樣本在每個位點的等位基

7、因類型和頻率,將各位點數(shù)據(jù)輸入軟件計算等位基因數(shù)目和期望雜合度,計算遺傳距離,并分析進化關(guān)系。
　　 本實驗中六個采集地區(qū)的樣本在種群結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性方面顯示出差異。從12個微衛(wèi)星位點檢測結(jié)果來看,云南三個采集地結(jié)果分別為:怒江流域樣本平均的等位基因數(shù)目為7.833±0.878,平均期望雜合度為0.680±0.059；瀾滄江流域樣本平均等位基因數(shù)目為5.083±0.668,平均期望雜合度為0.672±0.057；紅河地區(qū)樣本平均

8、等位基因數(shù)目為3.000±0.461,平均期望雜合度為0.527±0.074；海南三個采集地樣本結(jié)果分別為:三亞地區(qū)樣本平均等位基因數(shù)目為4.000±0.492,平均期望雜合度為0.582±0.083；樂東縣樣本平均等位基因數(shù)為4.250±0.592,平均期望雜合度為0.588±0.067；東方市樣本平均等位基因數(shù)為5.250±0.676,平均期望雜合度為0.619±0.061。遺傳距離計算及種群進化關(guān)系分析顯示,所有樣本分成兩大群體,

9、云南三個地區(qū)樣本為一個群體,海南三個地區(qū)樣本則為另一個群體。這與云南海南兩省的地理位置情況相一致。
　　 通過對所有樣本的12個微衛(wèi)星位點的分析,進一步篩選出具有地區(qū)差異性分布的位點,用于溯源檢測技術(shù)。首先根據(jù)先前進化關(guān)系分析,將云南三個采集地區(qū)合并為一個大的群體,同理將海南三個地區(qū)樣本合并,將樣本分為云南和海南兩個群體進行比較。依據(jù)云南與海南樣本在每個位點等位基因類型和頻率統(tǒng)計結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在Polyα、ARA2和TA87這三個位

10、點上,兩群體的等位基因類型呈現(xiàn)明顯差異的數(shù)目多于其他位點。將海南樣本按照Polyα-ARA2-TA87位點依次逐步分類,得到海南樣本的候選微衛(wèi)星單體型為Polyα(184/187bp)-ARA2(69bp)-TA87(102bp)；同理將云南樣本依照Polyα-TA87-ARA2位點順序逐步分類,得到云南樣本的候選微衛(wèi)星單體型為Polyα(166/175/178bp)-TA87(72bp)-ARA2(96/105bp)。隨后在本實驗單一

11、感染樣本中隨機抽取100例樣本,其中海南48例,云南52例。對照這些樣本在三個微衛(wèi)星位點類型,用得出的地區(qū)特異性單體型判斷每個樣本可能的來源地,再與該樣本實際采集地作比較看是否結(jié)果一致。最后這100例樣本中總的一致率達92%,其中海南樣本的一致率為93.8%,云南樣本一致率為90.4%。通過此結(jié)果可以初步驗證,本實驗分析推斷兩個群體候選單體型的過程可行,得到的兩個候選單體型作為地區(qū)特異的瘧原蟲遺傳標識,對溯源檢測技術(shù)具有應(yīng)用價值。但是仍