青香蕉蘋果α-法尼烯合成酶基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、α-法尼烯是果實(shí)中主要的香氣成分之一，具有許多重要的生物學(xué)功能，與昆蟲的誘導(dǎo)性有關(guān)。α-法尼烯是誘導(dǎo)虎皮病發(fā)生的重要因素，虎皮病是蘋果、梨在低溫貯藏中后期發(fā)生的最嚴(yán)重的生理病害之一。果皮中α-法尼烯的生物合成是通過類異戊二烯途徑中的甲羥戊酸途徑，α-法尼烯合成酶是調(diào)控α-法尼烯合成的關(guān)鍵酶，催化FPP轉(zhuǎn)變?yōu)棣?法尼烯。 為進(jìn)一步研究α-法尼烯合成酶的功能，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了青香蕉蘋果α-法尼烯合成酶基因正義、反義、RNAi表達(dá)載體；利

2、用RT-PCR的方法擴(kuò)增青香蕉蘋果α-法尼烯合成酶基因的全長，構(gòu)建亞細(xì)胞定位表達(dá)載體，對該酶進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究；建立并完善了青香蕉蘋果的高效再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化青香蕉蘋果和豐產(chǎn)梨，初步獲得轉(zhuǎn)基因植株。主要結(jié)果如下： 1.構(gòu)建正義和反義表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。 2.構(gòu)建α-法尼烯合成酶基因RNAi表達(dá)載體，酶切和測序結(jié)果表明RNAi目的片段已經(jīng)正確插入到構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體中。 3

3、.通過克隆青香蕉蘋果的α-法尼烯合成酶基因(AFS)全長，構(gòu)建PBI-AFS-GFP真核表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，瞬時(shí)表達(dá)AFS-GFP融合蛋白，首次發(fā)現(xiàn)該酶定位于細(xì)胞膜上。 4.以青香蕉蘋果的葉片為材料，進(jìn)行了不同激素配比及其它影響因子對葉片、根系再生和增殖影響的研究。結(jié)果表明：最適宜青香蕉葉片再生不定芽的培養(yǎng)基為MS+BA4.0mg/L+TDZ1.0mg/L+IAA0.8mg/L+蔗糖30.0g/L+瓊脂6.0g

4、/L，再生頻率高達(dá)100％，最適的暗培養(yǎng)時(shí)間為20天，葉片正放在培養(yǎng)基上的再生效果優(yōu)于反放，生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.7mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+瓊脂6.0g/L，最終建立了青香蕉蘋果葉片高效再生體系。 5.完善了青香蕉蘋果的遺傳轉(zhuǎn)化體系，確定在再生過程中Kan選擇壓為15mg/L；通過研究不同濃度的頭孢霉素和羧芐青霉素對農(nóng)桿菌的抑制效果，確定抑菌過程中以頭孢霉素100mg/L+羧芐青霉素100